吴晓强 王琰萍 余 波 官俏兵 张晓玲

浙江嘉兴市第二医院神经内科 嘉兴 314000

丰富环境（environmental enrichment，EE）是与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的社会心理治疗相对应的基础研究，通常指更大的活动空间、更多的个体间交往，以及所接触环境的多变性和新颖性［1］。快速衰老小鼠（SAM）是一种不同于家族性AD 的转基因模型小鼠，其与散发性AD 发病机制相关的Aβ沉积、tau蛋白的过磷酸化和氧化应激的一种自然突变的模型［2］。由日本京都大学胸病研究所Takeda［3］等通过对AKR／J系小鼠进行选择性地近交繁育而成。本研究探讨丰富环境可通过调节一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）的表达实现对SAMP 小鼠加速衰老期的学习记忆的改善。

1 材料与方法

1．1 实验动物及环境要求 3月龄清洁级雄性SAMP8小鼠24只（购自北京维通利华实验动物有限公司）。小鼠被安置于室内光照遵循12h明暗周期（07：00开灯，19：00熄灯）、恒定室内温度于20～22 ℃、湿度为（55±5）%的环境饲养4周，以熟悉周围。4 月龄SAMP8 小鼠［4-5］，采用数字 表分组法随机分成标准环境组（standard environment，SE）和丰富环境组（enrichmental environment，EE）。并淘汰不合格者（外部肿瘤、运动能力受限等，共4只）SE 组9只小鼠，SE 为长×宽×高为48．5cm×35cm×20cm 的无毒聚乙烯鼠盒，上为一不锈钢丝笼盖，笼底为无毒无味的的树木刨花垫料。EE组11只小鼠，EE为大小、质地与标准笼相同，内设有：组合式长隧道一套、爬梯1个，跑笼2个，数个颜色形状不同的道具，每日更换道具位置。

1．2 Morris水迷宫试验 直径120cm、高50cm 的圆形塑料水池，被等分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限，4个象限分别标有三角形、正方形、菱形、圆形作为入水点。直径10cm 的黑色平台置于水池的第四象限低于水面0．5～0．8cm，位置不变，用无毒染剂将池水染成黑色，水温控制在（21±2）℃。

定位航行实验：第1天动物在水池中自由泳以排除因运动障碍和焦虑无法完成游泳者。第2～4天进行，每日分别从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限的入水点，将每只小鼠面朝向池壁入水，同时开始计时小鼠找到平台并爬上平台所需的时间即逃避潜伏期。如小鼠在规定的时间内（90s）找不到平台，则由实验者将其引向平台，休息15～20s后，进行下一轮实验。

1．3 开放场试验 开放场大小：长×宽×高为60cm×60 cm×40cm 的圆形黑色活动箱，顶端为60 W 冷光灯，每次实验将小鼠从某一固定位置放入场地，并记录小鼠的爬格数、直立数、理毛次数和粪便颗粒数。记录时间为10min。每测试完一只小鼠，用蘸酒精的毛巾仔细擦拭，清除小鼠排泄物，以免影响下只小鼠的检测。

1．4 组织准备和NOS蛋白水平的检测 6月龄SAMP8小鼠断头取脑，分离海马，-70 ℃保存。脑组织混合5×总蛋白提取液（UBIO 公司）研磨后离心10min，取上清液，BCA 法蛋白浓度定量试剂盒（UBIO 公司）蛋白浓度检测，10%SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白质并转移到PVDF 膜，含5%脱脂牛奶Tis缓冲液封闭3h，分别用神经元型一氧化氮合成酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）一抗（CST公司）和β-actin一抗（SantaCruz公司）孵育过夜，二抗（SantaCruz公司）孵育2h，ECL 发光试剂盒（UBIO 公司）检测NOS的表达。

1．5 NOS的mRNA 表达的检测（Real-time PCR） 组织分离同上，使用Trizol试剂盒（Initrogen公司）提取SAMP8小鼠海马的总RNA。应用Takara公司cDNA 合成试剂盒和3种NOS的cDNA。PCR 引物见表1。

表1 PCR 引物

1．6 统计学分析 采用SPSS 13．0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组均数比较采用Student’st检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 丰富环境对SAMP8鼠的行为学影响 Morris水迷宫试验前1d所有小鼠自由游泳以排除运动缺陷者，连续3d定位航行实验中，EE 组在潜伏期（tday2＝4．15，P＜0．01；tday3＝4．42，P＜0．01；tday4＝4．06，P＜0．01）与游泳路程（tday2＝8．74，P＜0．01；tday3＝10．02，P＜0．01；tday4＝9．22，P＜0．01）均较SE 组明显下降，差异有统计学意义（P＜0．05）。2 组平均速度比较差异无统计学意义（均P＞0．05）。见表2和表3。

为排除焦虑因素干扰SAMP8鼠在Morris水迷宫试验结果，进行了10min开放场试验，在直立次数上EE 组与SE组比较差异有统计学意义（t＝3．93，P＜0．01），而穿格数、理毛次数及粪便颗粒数比较差异均无统计学意义（P＞0．05）。见表4。

2．2 丰富环境对SAMP8鼠的一氧化氮合成酶表达的影响 在SAMP8鼠海马区，SE组的nNOS、eNOS蛋白表达水平均较EE组下降（t＝5．42，P＜0．01；t＝3．83，P＜0．01），但iNOS蛋白表达水平2组差异无统计学意义（P＞0．05）。见图1。

图1 SAMP8鼠海马区一氧化氮合成酶表达比较

表2 2组Morris水迷宫潜伏期比较 （±s，s）

表2 2组Morris水迷宫潜伏期比较 （±s，s）

注：与EE组比较，＊P＜0．01

组别 n 第2天 第3天 第4天SE 9 86．57±6．97＊ 78．93±7．17＊ 75．90±5．05＊EE 11 74．92±4．82 66．51±3．53 67．57±5．14

表3 2组Morris水迷宫中SAMP8路程比较 （±s，mm）

表3 2组Morris水迷宫中SAMP8路程比较 （±s，mm）

注：与EE组比较，＊P＜0．01

组别 n 第2天 第3天 第4天SE 9 5 132．4±480．50＊ 4 754．87±635．10＊4 331．00±483．18＊EE 11 3 778．77±441．29 3 146．00±299．08 2 929．20±349．30

表4 SAMP8小鼠在开放场试验中行为指标比较 （±s）

表4 SAMP8小鼠在开放场试验中行为指标比较 （±s）

注：与SE组比较，＊P＜0．01

组别 n 直立次数 粪便颗粒数 理毛次数 穿格次数SE 9 18．22±2．90 3．44±0．56 2．11±0．42 77．50±4．83 EE 11 33．18±5．32＊2．91±0．51 2．82±0．57 91．85±9．65

同组SAMP8鼠对侧海马区，EE 组eNOS的mRNA 表达较SE组明显增多（t＝3．52，P＜0．01），而nNOS、iNOS的mRNA 表达水平差异均无统计学意义（P＞0．05）。见图2。

图2 SAMP8鼠海马区一氧化氮合成酶mRNA 表达比较

3 讨论

快速衰老型小鼠（SAMP8）为近交系小鼠，以寿命短，短期内出现类似人类衰老相关行为学和病理生理学等优势，已成为理想的AD 动物模型。SAMP8平均寿命为12个月，一般在4～6月龄出现加速衰老特点，且随年龄增长表现学习记忆障碍、低恐惧不安状态、情感障碍等。虽与人类β-淀粉样蛋白前体（APP）不同的是SAMP8 鼠神经系统主要是APP695，但其氨基酸序列89．5%同源于人类。若给SAMP8鼠注射Aβ的抗人抗体，海马免疫组化发现Aβ沉积呈年龄相 关 性［6］，Poon等［7］在SAMP8 鼠脑室内注射针对APP 的Aβ序列反义寡核苷酸减少APP 表达及其氧化应激形成蛋白羰基化，改善SAMP8鼠学习记忆功能。2月龄SAMP8鼠脑组织即可见Aβ沉积，4～9月龄加速沉积。与AD 相关的另一特征性tau蛋白，5月龄SAMP8鼠脑内过磷酸化tau蛋白开始增多［8］。为了更好进行SAMP8鼠行为学检测，本实验选取加速衰老期（4月龄）小鼠开始环境干预，6月龄时应用Morris水迷宫及开放场检测空间学习记忆能力及排除因衰老引起活动障碍及情感障碍等干扰因素。

Morris水迷宫是上世纪英国心理学家Morris设计，并应用于检测动物学习记忆的重要工具［9］，潜伏期、路程及平均速度是Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆的常用参数［10］。我们实验结果表明，EE 组学习记忆能力较SE 组明显增加，主要表现在潜伏期与游泳路程，但是平均速度两者差异无统计学意义，尽管已有研究将游泳速度作为描绘学习记忆的另一参数［1］，而其关系并非直接相关。Van Dam等［11］在APP23转基因模型实验中也发现组间的小鼠游泳速度之间无差异，换个角度思考，SAMP8鼠在速度相同的条件下利用较短的时间和距离找到潜在的平台说明了小鼠的学习记忆能力的提高，与实验结论并不矛盾，正如临床上AD患者与正常人在行动上速度上无明显差别类似。

另外，实验中为了不同层面探索丰富环境对SAMP8鼠的行为影响及排除焦虑对空间学习记忆的可能干扰，进行了开放场试验。直立次数与穿格数反映小鼠的探索能力；理毛次数与粪便颗粒数反映了小鼠对新环境的满意程度，即焦虑指标。实验中我们发现与焦虑相关指标（粪便颗粒、理毛次数）组间差异无统计学意义，且EE 组的垂直探索能力（直立次数）较SE组明显增强，支持了水迷宫结论。然而，与2组的水平探索能力相关的穿格数之间差异无统计学意义，但EE组较SE组存在增加趋势，考虑可能与系统计数及样本量有关。

研究证实，NOS与学习记忆密切相关［12-13］，目前发现神经系统存在3 种一氧化氮合成酶，分别为iNOS、eNOS、nNOS。NOS催化生成NO，低浓度NO 作为逆行递质活化鸟苷酸环化酶，增加突触后膜Ca2＋通透性，再次激活NOS，放大和延长神经信号，完成长时程增强，并可通过复杂信号网络，起促进神经生长及抗凋亡作用；高浓度NO 与氧自由基产生过氧亚硝酸根，诱导氧化应激，导致tau蛋白酪氨酸残基硝基化和羰基化，抑制过磷酸化tau蛋白分解，并阻碍热休克蛋白90介导tau蛋白正确剪切／聚集，共同促进神经纤维缠结形成。iNOS 是与AD 发病相关应激反应主要酶之一，可触发高浓度NO 而损伤学习记忆［14］。本实验未发现2组iNOS及其mRNA 的表达水平上存在差异，这可能与选取的SAMP8鼠的年龄相关，有理由推测iNOS可能参与晚期学习记忆损伤。nNOS和eNOS是生理条件下基础表达的组织构成酶，参与学习记忆障碍的整个进程，nNOS 基因敲除小鼠表现明显记忆功能损伤［15］，在SAMP8 小鼠海马区nNOS的表达随年龄增加而逐渐下降［16］。实验中发现丰富环境明显延缓随年龄增长而引起的nNOS蛋白水平下降，但Real-time PCR未检测到nNOS的mRNA 表达增加，推测丰富环境可能从翻译水平上影响nNOS的表达，有待进一步研究。eNOS主要来源于血管内皮细胞，目前，文献关于eNOS调节Aβ沉积一直存在争议，很可能与模型的选择或来源于NOS的NO 空间或时间分布差异有关，Austin等［17］发现通过抑制培养的脑血管内皮细胞或使用eNOS-／-小鼠可以上调APP、β降解酶和Aβ的沉积，与其结果一致，本实验EE组eNOS的蛋白和mRNA 表达水平均较SM 组增加，说明丰富环境，即活动空间增加、更多的个体间交往，以及所接触环境的多变性和新颖性可直接延缓学习记忆功能损伤，可能为脑血管事件参与学习记忆损伤提供证据。

综上所述，在SAMP8 鼠加速衰老期，丰富环境可能通过调节一氧化氮合成酶的表达水平延缓学习记忆能力衰退上发挥重要作用，为阿尔茨海默病的社会心理治疗提供理论支持。

［1］Frick KM，Fernandez SM．Enrichment enhances spatial memory and increases synaptophysin levels in aged female mice［J］．Neurobiol Aging，2003，24（4）：615-626．

［2］Pallas M，Camins A，Smith MA，et al．From Aging to Alzheimer’s Disease：Unveiling“The Switch”with the Senescence-Accelerated Mouse Model（SAMP8）［J］．J Alzheimers Dis，2008，15（4）：615-624．

［3］Takeda T，Matsushita T，Kurozumi M，et al．Pathobiology of the senescence-accelerated mouse（SAM）［J］．Exp Geronto，1997，32（1／2）：117-127．

［4］Gutierrez-Cuesta J，Sureda FX，Romeu M，et al．Chronic administration of melatonin reduces cerebral injury biomarkers in SAMP8［J］．J Pineal Res，2007，42（4）：394-402．

［5］Morley JE，Farr SA，Kumar VB，et al．The samp8 mouse：a model to develop therapeutic lnterventions for Alzheimer＇s disease［J］．Curr Pharm Des，2012，18（8）：1 123-1 130．

［6］Takemura M，Nakamura S，Akiguchi I，et al．Beta／A4proteinlike immunoreactive granular structures in the brain of senescence-accelerated mouse［J］．Am J Pathol，1993，142（6）：1 887-1 897．

［7］Poon HF，Joshi G，Sultana R，et al．Antisense directed at the Abeta region of APP decreases brain oxidative markers in aged senescence accelerated mice［J］．Brain Res，2004，1 018（1）：86-96．

［8］Canudas AM，Gutierrez-Cuesta J，Rodriguez MI，et al．Hyperp hosphorylation of microtubule-associated protein tau in senescence-accelerated mouse（SAM）［J］．Mech Ageing Dev，2005，126（12）：1 300-1 304．

［9］File SE，Wardill AG．The reliability of the hole-board apparatus［J］．Psychopharmacologia，1975，44（1）：47-51．

［10］Martinez-Coria H，Green KN，Billings LM，et al．Memantine improves cognition and reduces Alzheimer’s-like neuropathology in transgenic mice［J］．Am J Pathol，2010，176（2）：870-880．

［11］Van-Dam D，De-Deyn PP．Cognitive evaluation of disease-modi fyin g efficacy of galantamine and memantine in the APP23model［J］．Eur Neuropsychopharmacol，2006，6（1）：59-69．

［12］Böhme GA，Bon C，Lemaire M，et al．Altered synaptic plasticity and memory formation in nitric oxide synthase inhibitortreated rats［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（19）：9 191-9 194．

［13］Koylu EO，Kanit L，Taskiran D，et al．Effects of nitric oxide synthase inhibition on spatial discrimination learning and central DA2and mACh receptors pharmacol［J］．Biochem Behav，2005，81（1）：32-40．

［14］Medeiros R，Prediger RD，Passos GF，et al．Connecting TNFsignaling pathways to iNOS expression in a mouse model of alzheimer’s disease：relevance for the behavioral and synaptic deficits induced by amyloid protein［J］．J Neurosci，2007，27（20）：5 394-5 404．

［15］Wultsch T，Chourbaji S，Fritzen S，et al．Behavioral and expressional phenotyping of nitric oxide synthase-1knockdown animals［J］．J Neural Transm Suppl，2007，（72）：69-85．

［16］Han S，Rudd JA，Hu ZY，et al．Analysis of neuronal nitric oxide synthase expression and Increasing astrogliosis in the brain of senescence-accelerated-prone 8 mice［J］．Int J Neurosci，2010，120（9）：602-608．

［17］Austin SA，Santhanam AV，Katusic ZS．Endothelial nitric oxide modulates expression and processing of amyloid precursor protein［J］．Circ Res，2010，107（12）：1 498-1 502．