刘晶晶，王　烨，韩曜平，王雪锋，戴阳军

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性研究

刘晶晶，王烨，韩曜平，王雪锋，戴阳军

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

以河蚬抗氧化肽清除羟自由基的活性变化为指标，研究温度、pH、食品原料、防腐剂和不同金属离子对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响。结果表明：河蚬抗氧化肽具有较强的耐热性，加热到100℃仍能保持95%以上的活性；在酸性环境中活性保持较好，在碱性条件下丧失较快；蔗糖、NaCl对河蚬抗氧化肽的稳定性影响不明显，而葡萄糖和山梨酸钾会明显降低河蚬抗氧化肽活性（p＜0.05）；K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等金属离子对河蚬抗氧化肽稳定性均有不同程度的影响，其影响大小顺序为：Cu2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+。

河蚬，抗氧化肽，抗氧化稳定性，羟自由基清除率

机体氧化产生的自由基与人体衰老、许多疾病有关［1-2］。抗氧化肽由于其良好的抗氧化活性、低毒、分子量低易吸收等特性而成为近年来研究的热点之一［3］。

河蚬，学名（Corbicula flum inea），又称黄蚬、金蚶、扁螺等，是双壳类软体动物，是我国重要的经济贝类之一。广泛分布于我国湖泊、江河中，天然资源丰富。河蚬含有丰富的蛋白质（干样中粗蛋白含量达66%以上）［4］、糖原、必需氨基酸、牛磺酸、多种维生素，以及钙、磷、铁、硒等具有特殊生理作用的矿物质，还含有活性肽等生理活性物质。由于河蚬所具有的营养、药用及食疗价值，对河蚬的开发研究越来越受到国内外专家和学者的关注。邱春江等［5］利用木瓜蛋白酶水解花蚬蛋白，得到的酶解物具有很强的清除羟自由基能力。刘杰等［6］研究了河蚬酶解液的体外抗氧化作用，发现酶解液具有显著的清除超氧阴离子自由基和羟自由基作用。张磊等［7］探讨了河蚬提取物可能通过抑制脂质过氧化反应对酒精性肝损伤有保护作用。韩鹏等［8］研究了河蚬乙酸乙酯提取物对DPPH自由基具有一定的清除作用。

近年来利用可控酶解技术从水产品中制备抗氧化活性肽的研究时有报道，如Je等［9］采用海鱼副产物（如鳕鱼骨架蛋白、青鳕鱼皮胶原蛋白、阿拉斯加青鳕鱼骨架蛋白等）制备出具有抗氧化活性的水解产物；Suetsuna［10］、Wu等［11］分别采用沙丁油鱼、鲭鱼水解得到了鱼类抗氧化肽。

目前，河蚬资源主要以鲜销为主，或者制成蚬干、咸蚬、罐头等粗加工方面，河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥其应有的利用潜能，随着我国养殖业的迅猛发展和人工饲养技术的不断提高，河蚬产量的逐年增长也为河蚬抗氧化肽的开发与综合利用提供了丰富的原料来源。

本实验室通过酶处理技术对河蚬肉进行酶解，得到了有较强抗氧化能力的肽混合物。本文进一步研究温度、pH、食品原料、防腐剂和不同金属离子对河蚬抗氧化肽稳定性的影响，旨在为河蚬抗氧化肽作为功能性抗氧化剂的生产和应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

速冻河蚬肉江苏省宿迁楠景水产品有限公司；中性蛋白酶蛋白酶活力不小于60000U/g，KAYON公司生产；邻二氮菲、无水乙醇、双氧水、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠、蔗糖、葡萄糖、NaCl、山梨酸钾、氯化铜、硝酸锌、硫酸钙、氯化镁、氯化钾、抗坏血酸均为分析纯。

UV-754紫外分光光度计上海精密科学仪器有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；SQ2119B食品料理机上海帅佳电子科技有限公司；EL104电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司；BCD-216TDXZ冰箱青岛海尔股份有限公司；HHS-11-2水浴锅江苏金坛宏凯仪器厂；RE-52A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；ALPHA1-4冷冻干燥机德国MARTIN CHRIST公司；PHS-3C精密pH计上海雷磁精密仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1河蚬抗氧化肽制备根据本实验室前期的研究结果，得工艺为：河蚬肉流水解冻→以料液比1∶2（g/mL）加水后用食品料理机匀浆→调节pH至6.0→添加0.94%中性蛋白酶（w/w），置于55℃恒温水浴锅中酶解4h→沸水浴中灭酶10min→冷却至室温→4000r/min离心20min→收集上清液→超滤膜（5000D）超滤→透过液→冷冻干燥→抗氧化肽粗品。

1.2.2羟自由基清除能力测定参照赵谋明等［12］的方法。取浓度为5mmol/L邻二氮菲0.6m L于试管中，加入0.15mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.4）0.4m L，混合均匀后加入浓度为5mmol/L FeSO4溶液0.6m L，充分摇匀，加入样品2m L（质量浓度为10g/L）以及0.1%H2O20.4m L，混匀，37℃保温1h后，测样品管在波长536nm处的吸光值A样品。选用去离子水代替样品液后重复上述工作，得损伤管吸光度值A损伤，采用去离子水代替样品液和H2O2溶液，得到未损伤吸光度A未损伤。清除率计算公式如下：

1.2.3河蚬抗氧化肽活性保持率测定分别测定河蚬抗氧化肽处理前的羟基自由基清除率A1和处理后的羟基自由基清除率A2，则其活性保持率为：

1.2.4河蚬抗氧化肽稳定性影响因素实验参照参考文献［12-14］的方法进行实验设计。

1.2.4.1温度对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响取河蚬抗氧化肽（质量浓度为10mg/m L）2m L于具塞试管中，分别在水浴锅（50、70、90、100℃）热处理1h，测定其活性保持率。

1.2.4.2pH对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响取河蚬抗氧化肽（质量浓度为10mg/m L）2m L于具塞试管中，分别用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节pH至2、3、4、5、6、7、8、9后，测定其活性保持率。

1.2.4.3食品原料对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响取河蚬抗氧化肽（质量浓度为10mg/m L）2m L于具塞试管中，分别添加1m L不同质量分数蔗糖（2%、4%、6%、8%、10%）、葡萄糖（2%、4%、6%、8%、10%）、NaCl（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）溶液，测定其活性保持率。

1.2.4.4防腐剂对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响取河蚬抗氧化肽（质量浓度为10mg/m L）2m L于具塞试管中，分别添加1m L不同质量分数（0.004%、0.008%、0.012%、0.016%、0.020%）山梨酸钾溶液后，测定其活性保持率。

1.2.4.5金属离子对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响取河蚬抗氧化肽（质量浓度为10mg/m L）2m L于具塞试管中，分别添加1m L浓度分别为5、10、50、100、500mg/L的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金属离子溶液，测定其活性保持率。

1.2.5数据统计分析所有实验至少3次重复，采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1温度对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响

温度对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响结果见图1，河蚬抗氧化肽溶液在温度为50～90℃范围内加热1h时，活性保持率为100%；加热到100℃仍能保持95%以上的活性。这说明在一定温度范围内河蚬抗氧化肽对羟自由基清除率影响不明显，可以耐受加工过程较高温度的处理。

图1　温度对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响Fig.1　Effectof temperature on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

2.2pH对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响

pH对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响结果见图2，在pH＜7的条件下对河蚬抗氧化肽抗氧化活性影响很小，在极酸环境（pH=2）下仍能保持95%以上活性；但当pH＞7时活性丧失很快；pH=9时，活性仅剩40.2%，说明河蚬抗氧化肽不耐碱。河蚬抗氧化肽不耐碱可能是由于在碱性条件下发生了脱酰胺或者消旋反应而使肽链的构象发生了改变，从而导致活性丧失［15］。

图2　pH对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响Fig.2　Effectof pH on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

2.3食品原料对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响

葡萄糖对河蚬抗氧化肽抗氧化活性的影响见图3。由图3可知，在实验浓度范围内，随着葡萄糖浓度增加，河蚬抗氧化肽的活性呈下降趋势；当葡萄糖浓度为2%、4%和6%时，对抗氧化肽活性的影响没有显著性差异（p＞0.05），且葡萄糖浓度为2%时，对抗氧化肽的活性影响很小，活性保持率为98.5%；葡萄糖浓度为10%时，活性保持率仅为60.1%。

图3　葡萄糖对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响Fig.3　Effect of glucose on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

蔗糖对河蚬抗氧化肽抗氧化活性的影响见图4。蔗糖浓度在2%～10%范围内，对河蚬抗氧化肽的活性影响没有显著性差异（p＞0.05），活性均保持在90%以上。

图4　蔗糖对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响Fig.4　Effectof sucrose on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

由于食品加工过程经常用到NaCl，NaCl对河蚬抗氧化肽抗氧化活性的影响见图5。由图5可知，不同浓度的NaCl对河蚬抗氧化肽的活性保持率均有影响，呈现下降的波动趋势。当NaCl浓度为0.5%和1.0%时，对河蚬抗氧化肽抗氧化活性影响没有显著性差异（p＞0.05），活性均保持在90%以上；当NaCl浓度为1.5%、2.0%和2.5%时，对河蚬抗氧化肽抗氧化活性影响没有显著性差异（p＞0.05），但活性保持率稍低，均在80%以上。由此可见，脱盐处理能较好保证河蚬抗氧化肽的抗氧化性。

图5　NaCl对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响Fig.5　Effectof NaCl on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

食品原料中，浓度为8%、10%的葡萄糖对河蚬抗氧化肽影响差异显著（p＜0.05），不同浓度蔗糖和NaCl对河蚬抗氧化肽影响没有显著性差异（p＞0.05）。

2.4防腐剂对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响

从图6可以看出，在实验浓度范围内，随着山梨酸钾浓度增加，河蚬抗氧化肽活性保持率呈下降的趋势，且不同浓度的山梨酸钾对河蚬抗氧化肽活性的影响有显著性差异（p＜0.05）；当山梨酸钾浓度达到0.02%时，其活性保持率仅为33.8%，其原因有待进一步研究。

图6　山梨酸钾对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响Fig.6　Effectof potassium sorbate on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

2.5金属离子对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响

不同金属离子对河蚬抗氧化肽抗氧化活性的影响结果见图7。随着金属离子浓度增加，河蚬抗氧化肽抗氧化活性均有不同程度的下降。说明河蚬抗氧化肽对金属离子较为敏感，其影响顺序依次为：Cu2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+。其中Cu2+影响最为明显，当Cu2+质量浓度达到100mg/L时，活性完全丧失，说明河蚬抗氧化肽对Cu2+非常敏感。而不同浓度的K+和Mg2+对河蚬抗氧化肽活性影响较小，且不同浓度之间没有显著性差异（p＞0.05）。

图7　金属离子对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性的影响Fig.7　Effectofmetal irons on antioxidation stability of antioxidant peptides from Corbicula fluminea

3　结论

3.1河蚬抗氧化肽具有很好的耐热性，加热到100℃仍能保持95%左右的抗氧化活性；酸性条件对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性影响不显著，极酸环境（pH＝2.0）时仍能保持95%以上的活性。在碱性条件下活性损失较快，当pH增加到9.0时，河蚬抗氧化肽抗氧化活性仅为40.2%。

3.2蔗糖、NaCl对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性影响不显著，而葡萄糖、山梨酸钾则会明显降低河蚬抗氧化肽的抗氧化活性。

3.3常见的金属离子对河蚬抗氧化肽抗氧化稳定性影响不一，影响大小先后顺序为Cu2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+。其中Cu2+影响最大，较高浓度下会使活性完全丧失；K+、Mg2+影响较小，在生产和加工河蚬抗氧化肽时应尽量避免与含Cu2+材料接触。

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Study on antioxidation stability of antioxidant peptide from Corbicula flum inea

LIU Jing-jing，WANG Ye，HAN Yao-ping，WANG Xue-feng，DAIYang-jun
（Departmentof Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China）

The change of scavenging ac tivity on hyd roxyl free rad ical of antioxidant pep tide from Corbicula flum inea was the index to study the effect of temperature，pH，food ingredients，p reservatives and different metal ions on antioxidation stability of the pep tide.The results showed that antioxidant pep tide from Corbicula flum inea had strong heat-resistance，heated to 100℃stillmaintained more than 95%active.Itmaintained high activity in acid ity environment，but losed its activity in alkaline environment.Surcrose and NaCl had little effects on its antioxidation stability，but g lucose and potassium sorbate lowered the oxidation stability of antioxidant pep tide from Corbicula flum inea（p＜0.05）.Metal ions such as K+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Cu2+affected the stability，and the orderwas Cu2+＞Zn2+＞Ca2+＞K+＞Mg2+.

Corbicula flum inea；antioxidant pep tide；antioxidation stability；hyd roxyl free rad ical scavenging

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0086-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.011

2014-08-04

刘晶晶（1978-），女，硕士，副教授，研究方向：食品加工和天然产物活性物质的开发与利用。

江苏省苏州市应用基础研究计划项目（SYN201303）。