李晓非，梁桂亮，普 冬，杨冬梅，赵 旻

（1.武汉大学基础医学院生物医学工程系，湖北武汉430071；2.昆明市第三人民医院检验科，云南昆明650000）

基因芯片技术在分枝杆菌菌种鉴定和结核耐药性检测中的应用及评价

李晓非1，2，梁桂亮2，普 冬2，杨冬梅2，赵 旻1＊

（1.武汉大学基础医学院生物医学工程系，湖北武汉430071；2.昆明市第三人民医院检验科，云南昆明650000）

目的探讨基因芯片技术在结核病快速诊疗中的应用价值。方法对抗酸染色涂片阳性的肺结核患者痰标本同时进行基因芯片菌种鉴定和BACTEC MGIT 960培养，对结核阳性的样本分别用以上两种方法检测利福平和异烟肼的耐药性。以培养法为参考方法，评价基因芯片法菌种鉴定和耐药检测的敏感度、特异度和符合率。采用Kappa检验分析两种方法的一致性。结果656例涂片阳性的患者中，两种方法各检出非结核分枝杆菌21例，符合率为100%。耐药性检测发现，基因芯片对利福平的敏感度为87.8%（86／98），特异度为96.0%（410／427），符合率为94.5%（496／525），Kappa值为0.84，P＞0.05；对异烟肼的敏感度为81.9%（96／116），特异度为91.7%（375／409），符合率为89.5%（470／525），Kappa值为0.71，P＞0.05；两种药物药敏结果总符合率为92.0%（966／1 050）。结论基因芯片技术能够准确地筛选出非结核分枝杆菌；对利福平和异烟肼耐药性检测与培养法有很好的符合率和高度一致性，而且能够快速、准确地检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，在结核病的快速诊疗领域具有广阔的应用前景。

基因芯片；分枝杆菌；结核；检测；符合率；利福平；异烟肼

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0204）

结核病是一种由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的严重危害人类健康和生命的传染病，是全球主要的公共卫生问题之一，也是造成人类死亡最多的疾病之一［1］。结核疫情由于疫苗和药物的使用曾一度得到较好的控制，但近年来伴随HIV感染的流行、MTB耐药菌株的出现以及人口流动的增加，全球疫情又急剧恶化。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二位，仅次于印度［2］。一直以来困扰结核病防治的难点：一是不能有效地检出结核菌，不利对患者的及时正确救治；二是对患者用药的耐药情况不能及时检测，不能做到针对性的联合用药治疗。传统的检测手段已不能满足临床需求。随着90年代以来生物芯片技术不断研究，基因芯片技术也开始应用到分枝杆菌的检测中［3，4］。与传统方法相比，生物芯片技术具有快速、结果可靠、重复性好、通量高、可以在一个反应中检测成千基因表达的特点，为分枝杆菌的实验室诊断开拓新途径。为探讨基因芯片技术在结核病快速诊疗中的应用价值，笔者就我院近期检测的情况进行以下统计分析。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选择2013年1月至12月本院结核科涂阳肺结核住院患者656例纳入观察。每例患者采集清晨第一口痰2－5ml吐入无菌容器内及时送检，同时进行培养和基因芯片检测。质控菌株购自美国国家菌种保存中心，共18株：结核分枝杆菌H37Rv（ATCC27294）、结核分枝杆菌（ATCC25177）、胞内分枝杆菌（ATCC13950）、鸟分枝杆菌（ATCC25291）、龟分枝杆菌（ATCC35752）、脓肿分枝杆菌（ATCC19977）、戈登分枝杆菌（ATCC14470）、偶然分枝杆菌（ATCC6841）、不产色分枝杆菌（ATCC19530）、堪萨斯分枝杆菌（ATCC12478）、浅黄分枝杆菌（ATCC43903）、金色分枝杆菌（ATCC19527）、瘰疬分枝杆菌（ATCC19981）、土地分枝杆菌（ATCCl5755）、草分枝杆菌（ATCC11758）、溃疡分枝杆菌（ATCC19423）、蟾蜍分枝杆菌（ATCC19250）、耻垢分枝杆菌（ATCC19420）。

1.2 仪器和试剂

BACTEC MGIT 960结核培养仪及配套试剂由美国BD公司生产；结核分枝杆菌抗原检测试剂（胶体金法）由杭州创新生物检验技术公司生产；基因芯片检测平台及配套试剂：为北京博奥生物有限公司研制开发。

1.3 方法

同一份痰标本加入等量0.5%N－乙酰半胱氨酸和氢氧化钠（NALC－NaOH）前处理液，漩涡振荡液化15－20min，吸取1m1消化液于1.5ml离心管中，用于基因芯片检测，剩余样本用于结核培养。核酸扩增：1ml液化好的痰液转入洁净离心管中，12 000rpm离心5min，弃上清在离心管中加1ml洗液，漩涡振荡混均后12 000rpm离心5min，弃上清（洗液为EDTA或生理盐水），向离心管加入80μl核酸提取液，漩涡振荡混均后转入核酸提取管中，使用晶芯Extractor TM 36核酸快速提取振荡5min将核酸提取管置于95℃水浴5min取出核酸提取管，5 000rpm离心1min。试剂盒B部分取出“PCR扩增试剂1、2、3”解冻摇匀后分装18μl反应体系中加入2μl模板溶液，按分枝杆菌菌种鉴定PCR扩增程序进行PCR扩增。杂交：试剂盒B部分中取出“杂交缓冲液”，50℃热浴10min，PCR产物置于PCR仪中95℃变性5min，随后立即置于冰水混合物中骤冷冰浴3min，取出PCR产物，按照9 μl杂交缓冲液、6μl PCR产物的比例配制杂交混合物，按照杂交盒（两端底部各加100μl蒸馏水）、托架、芯片、盖片顺序装配好杂交反应盒，吸取13.5μl杂交混合物经加样孔加入芯片点阵中，盖好盒盖并使用金属封条密封杂交盒，50℃预热BioMixerTMⅡ芯片杂交仪20min以上，完成后将杂交盒平稳放入杂交仪托盘，并注意将3只或6只杂交盒全部放入，以使托盘平衡，运行分枝杆菌菌种鉴定芯片杂交程序，杂交条件为50℃杂交2h，转速为5rpm。洗干机洗液配制、洗涤和干燥：从试剂盒A部分中取出洗液原液（20×SSC、10%SDS）配制洗液Ⅰ→依次将20×SSC、蒸馏水、10%SDS按照10∶88∶2比例加入并混合；洗液Ⅱ→将20×SSC、蒸馏水按照1∶99的比例混合。预热SlideWasher TM 8芯片洗干仪，进行洗涤甩干。结果判读：开启扫描仪，运行分枝杆菌菌种鉴定芯片判别系统，预热激光10min。将完成洗涤、甩干的芯片插入扫描仪插槽内，详细记录判读结果和芯片信息。使用结核耐药检测芯片判别系统对核酸提取、扩增结果进行判读。

1.5 统计方法

采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。Kappa检验评价两种方法检测结果的一致性，Kappa值0.41－0.60具有中度一致性，0.61－0.8具有高度一致性，0.8l－1.0具有最强一致性。

2 结果

2.1 检测一般情况

在所有进行培养的样本中，有65例培养阴性（9.9%，65／656），38例培养污染（5.8%，38／656），分枝杆菌培养阳性并进行结核分枝杆菌（MTB）与非结核分枝杆菌（NTM）分群鉴别553例，21例菌种鉴定结果为NTM（3.8%，21／553），最后获得可用于分析药敏结果者532例。在进行基因芯片检测的标本中，有未检测到MTB40例（6.1%，40／656），无法判读结果10例（1.5%，10／656），NTM 21例（3.5%，21／606），总计获得可用于分析基因芯片结果者585例。综合培养药敏结果和基因芯片结果，最终有525例患者的检测结果进行利福平和异烟肼的药物敏感性比较。

2.2 菌种鉴定检测结果

两种方法分别检出NTM 21例，以培养法为参考方法，菌种鉴定的符合率为100%。21例NTM中，胞内分枝杆菌5例、鸟分枝杆菌2例、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌3例、戈登分枝杆菌2例、偶然分枝杆菌1例、不产色分枝杆菌3例、堪萨斯分枝杆菌1例、浅黄分枝杆菌3例、金色分枝杆菌1例，菌种分布达9种。

2.3 药物敏感性实验结果

基因芯片可同时检测MTB对利福平和异烟肼的耐药性。

利福平的耐药性检测结果：525例患者有496例基因芯片法与培养法结果一致。以培养法为参考方法，基因芯片法的符合率为94.5%，敏感度为87.8%；特异度为96.0%。敏感度和特异度比较，差异无统计学意义（χ2＝0.154，P＝0.695），见表1。

表1 基因芯片法和培养法检测利福平药物敏感性比较

异烟肼耐的药性检测结果：525例患者有470例基因芯片法与培养法结果一致。以培养法为参考方法，基因芯片法的符合率为89.5%，敏感度为81.9%，特异度为91.7%。敏感度和特异度比较，差异无统计学意义（χ2＝0.899，P＝0.343），见表2。

表2 基因芯片法和培养法检测异烟肼药物敏感性比较

3 讨论

BACTEC MGIT 960系统是目前最为理想的快速MTB培养、鉴定和药敏试验检测系统［7］，较传统方法缩短了报告时间，但确诊仍需14－28天［8］，大大影响了临床的时效性和易用性，导致了治疗的不准确和经验性用药，因此筛选快速、经济、适用性强的技术进行结核菌及药敏的常规检测，对早期指导临床选择药物、制定治疗方案有重要意义。近年来NTM感染呈上升趋势，据全国流行病学抽样调查结果显示，NTM在分枝杆菌培养阳性标本中的比例由1990年的4.9%增加至2000年的11.1%［9］，2010年增至22.9%［10］。NTM与MTB同属抗酸杆菌，且临床特征相似，故极易误诊误治［11］，而NTM对常规抗结核药具有较高的耐药性［12－13］，因此，一个有效的方法就是分离鉴定出NTM菌种。本文656例抗酸染色涂片阳性的患者中，培养法和基因芯片法各检出非结核分枝杆菌21例，符合率100%，与何莉等［14］报道的95.8%接近，说明基因芯片技术能快速、准确地筛选出非结核分枝杆菌，将大多数分枝杆菌鉴定到种，对结核病的确诊有较大帮助。

MTB的耐药性检测是结核病治疗的关键，主要有表型检测法和基因型检测法两大类。随着近年来新的实验诊断技术不断出现，基因型检测法越来越多的应用于结核的药物敏感实验［7］。目前商品化的基因型药敏检测技术主要有GeneXpert检测系统、结核分枝杆菌线性探针技术及基因芯片技术等。有文献报道［15］，以上方法检测利福平耐药性或者利福平和异烟肼的耐药性均有较高的敏感度和特异度，但GeneXpert系统只能检测利福平一种药物的耐药性，结核分枝杆菌线性探针技术不能进行分枝杆菌的菌种鉴定，因而在结核病的快速诊疗方面，基因芯片技术具有更大的优势。本文基因芯片法对利福平的敏感度87.8%（86／98），特异度96.0%（410／427），与培养法符合率94.5%（496／525），Kappa值0.84，P＞0.05；对异烟肼的敏感度81.9%（96／116），特异度91.7%（375／409），与培养法符合率89.5%（470／525），Kappa值0.71，P＞0.05；两种药物药敏结果总符合率为92.0%（966／1050）；与刘厚明等［16］研究结果较为接近，说明MTB耐药性检测基因芯片法和培养法结果高度一致，基因芯片法能准确地检测MTB对利福平和异烟肼的耐药性。

综上所述，基因芯片技术检测分枝杆菌以及MTB对利福平和异烟肼耐药性方面具有较高的敏感度和特异度，与传统方法比较，具有快速、灵敏、特异性强等特点，是一种值得推广的更高效、更快捷、更安全的结核病的实验室诊断方法，在结核病的快速诊疗领域具有广阔的应用前景。

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Application evaluation of Gene chip technology in the identification of Mycobacterium species and determination of anti－tu－berculosis drug resistance

LI Xiao－fei1，2，LIANG Gui－liang2，PU Dong2，et al.（1.Department of Biomedical Engineering，Basic Medical College of Wuhan University，Wuhan，Hubei 430071，China；2.Department of clinical laboratory，The third people＇sHospital of Kunming，Kunming，Yunnan 650000，China）

ObjectiveStudy on the application value of rapid diagnosis and treatment of tuberculosis with Gene chip technology.MethodsMycobacterium species of sputum specimens of tuberculosis（positive acid fast stain）were identified by Gene chip technology and were cultured by BACTEC MGIT 960.Detection of tuberculosis？positive samples resistance to rifampin and isoniazid using Gene chip technology and culture method with BACTEC MGIT 960.Culture method with BACTEC MGIT 960was used as the reference method，Evaluation of the sensitivity，specificity，coincidence rate and the consistency of two methods of Gene chip technology in the identification of Mycobacterium species and drug resistance detection，Results21non－tuberculosis Mycobacterium were detected by the two methods in 656 patients with the smear－positive tuberculosis，the coincidence rate was 100%.The sensitivity was 87.8%（86／98），the specificity was96.0%（410／427），the coincidence rate was 94.5%（496／525），Kappa value 0.84in the gene－chip detecting rifaman－resistance Mycobacterium tuberculosis.The sensitivity was 81.9%（96／116），the specificity was 91.7%（375／409），the coincidence rate was 89.5%（470／525），Kappa value 0.71in the gene－chip detecting isoniazid－resistance Mycobacterium tuberculosis.ConclusionGene chip technology is an effective method for accurate screening of non－tuberculosis Mycobacterium.Gene chip technology and culture method with BACTEC MGIT 960had a high coincidence rate and high consistence in the two methods detecting rifaman－resistance and isoniazid－resistance Mycobacterium tuberculosis.Gene chip technology has wide application prospect in diagnosis and treatment of tuberculosis patients，as it allows fast and accuracy detection of the resistance to Rifampin and Isoniazi in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.

Gene chip；Mycobacterium；Tuberculosis；Detection；Coincidence rate；Rifampin；Isoniazid

李晓非（1971－），女，本科，主任技师，从事传染病原检测方面的研究；赵旻（1972－），男，博士学历，副研究员，肿瘤和病毒性疾病的分子机制方面的研究。

2014－03－09）

1007－4287（2015）02－0204－04

＊通讯作者

Q789

A