秦丽娜(中山大学中山医学院，广州 510080)

·论著·

明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料的构建及其生物相容性检测

秦丽娜(中山大学中山医学院，广州 510080)

摘要：目的构建明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料，并检测其生物相容性。方法混合明胶、壳聚糖溶液后加入微量神经营养素3，将混浊液注模成型后冷淋干燥制备明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料，利用扫描电子显微镜观察支架材料形态，液体代替法测算孔隙率。提取明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料浸提液，观察其对神经干细胞活性的影响及对全反式维甲酸预诱导的神经干细胞分化的影响，并采用膜片钳技术检测诱导分化前后细胞的电生理特性。结果明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料内径为(267.0±13.8)μm，孔隙率为90.0%。神经干细胞在支架材料上生长良好，在全反式维甲酸诱导下形态向神经元样细胞改变，并初步表现出神经元间突触连接的结构，且诱导分化的神经元样细胞初步具备神经元细胞的电生理特性。结论成功构建了明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料，其与神经干细胞之间的生物相容性良好。

关键词：脊髓损伤；支架材料；神经营养素3；维甲酸；神经干细胞

脊髓损伤常导致偏瘫、截瘫，其修复仍然是全球性医学难题。在脊髓损伤的过程中，除机械损伤外，还包含局部微环境的损伤，主要包括细胞和组织的丢失、继发的缺血缺氧、自由基生成等不利于修复的因素。研究人员以组织工程学为基础，紧紧围绕种子细胞、细胞因子、组织工程支架这3个要素[1]，进行了大量脊髓损伤修复的实验研究，并取得了一些较好的效果[2,3]。本实验采用明胶、壳聚糖为原料，并复合神经营养素3，制备神经支架，观察其对全反式维甲酸预诱导的神经干细胞分化的影响。

1材料与方法

1.1实验材料及制备明胶(生物级)、神经营养素3试剂购自天津市科密欧化学试剂有限公司；壳聚糖(脱乙酰度95%)购自美国Sigma公司；冰醋酸、NaOH、碳酸钾、NaCl均为市售分析纯。人工脑脊液成分：2 mmol/L CaCl2、1.25 mmol/L NaH2PO4、125 mmol/L NaCl、25 mmol/L NaHCO3、2.5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2和25 mmol/L葡萄糖(pH 7.4)。电极内液成分:120 mmol/L葡萄糖酸钾、10 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L EGTA和20 mmol/L KCl(pH 7.2)。对于收集动作电位、自发兴奋性突触后电位的电极内液成分:0.5 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、135 mmol/L葡萄糖酸钾、5 mmol/L HEPES、5 mmol/L KCl、5 mmol/L EGTA、5 mmol/L Na2ATP。灌流液成分:25 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/L MgCl2、3.6 mmol/L KCl、117 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、1.2 mmol/L NaH2PO4和11 mmol/L葡萄糖(pH 7.4,利用NaOH调整)。

1.2明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料的构建将明胶溶于去离子水，40 ℃水浴加热，配成10%明胶溶液；将壳聚糖溶于2%的醋酸溶液中制备成2%的壳聚糖溶液。将明胶∶壳聚糖两种溶液按质量分数4∶6的比例混合[4]。然后再次放入40 ℃水浴中搅拌混匀，同时加入微量神经营养素3，采用超声分散，磁力搅拌法搅拌均匀，静置24 h。将制备成功的悬浊液缓慢注入内径为250 μm、外径为280 μm、长200 mm的硅胶套管中，铅丝密封两端。采用冷淋技术，将注模成功的样品缓慢浸入深低温冷淋剂(液氮)中，完全浸入液面后保留30～60 min，放入-80 ℃冰箱中保留30～60 min，使混悬液中沉淀物周围形成连续、相互沟通的溶剂冰晶网架构。将制备成功的200 mm长明胶—壳聚糖复合神经营养素3悬浊液的硅胶管冷冻体，精确切成30 mm短节段，放置于预冷好的铝弯盘中，置入Alphal-2型冷冻干燥机，在-60 ℃、100 mtorr下冷冻干燥24 h。支架中的溶剂冰晶升华后得到具有微孔结构的支架架构。真空状态下升温至0 ℃并维持6 h，继续升温至22 ℃维持30～60 min，解除真空后升至常温，得到干燥成形的明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料。

1.3明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料形态观察和孔隙率测量随机抽取20根明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料，利用常规方法对神经支架材料喷金镀膜，采用扫描电子显微镜观察支架材料的形态。采用目前较为常用的液体代替法测算孔隙率。使用75%乙醇溶液为替换液体，将神经支架材料(干重W)放入可密封容器中，浸入乙醇(体积V1)，使用负压抽吸支架材料内气体，直至无气泡逸出。测量乙醇及乙醇—神经支架总体积V2。缓慢取出支架，测量剩余乙醇(体积V3)。计算公式：孔隙率=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。其中V1-V3为神经支架中乙醇体积，V2-V3为神经支架本身体积。

1.4明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料的生物相容性检测①明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料浸提液的制备：取神经支架材料100 mg置于20 mL离心管中，将其与3 mL细胞培养液混合，置于37 ℃恒温振荡培养箱(100 r/min)24 h后，提取浸提液，加入α-MEM培养液，混合比例为1∶9，震荡摇匀。全部过程需无菌操作。②神经干细胞的分离培养：参照既往培养神经干细胞方法的实验研究[5]，在无菌超净台下，选新生1～2 d纯种SD乳鼠3只，取大脑皮质，PBS反复冲洗后，将组织放入DMEM/F12混合液中浸泡漂洗。滤网取出组织块后得到细胞悬液。调整细胞浓度为1×108个/mL，同时向DMEM/F12培养液中添加B27、表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，三者浓度均为20 ng/mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养2 d后换液。7 d后将细胞移入离心管，100 r/min离心，5 min后，0.25%胰蛋白酶消化3 min，使用含N2的DMEM-F12细胞培养液吹打重悬后进行常规培养。每3 d换液1次，每7～10 d传代1次。③神经干细胞活性检测：将第3代神经干细胞以5×107/L的浓度移入24孔培养板，设实验组和对照组，实验组加支架材料浸提液0.2 mL，对照组加含体积分数10%胎牛血清的培养液0.2 mL，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每2 d进行1次半量换液，培养14 d。采用MTT法检测神经干细胞活性[6,7]，通过酶联免疫检测仪，在570 nm波长的条件下，测定两组细胞第1、5、10、14天的吸光度。④全反式维甲酸预诱导前后神经干细胞形态观察：将支架材料按照12孔培养板大小剪成圆片状置于12孔培养板中，与浓度为1×107/L的第3代神经干细胞在37 ℃、5%CO2、饱和湿度下共培养。在共培养前，将EGF、bFGF从神经干细胞培养液中去除，同时移入全反式维甲酸和胎牛血清，维甲酸浓度为1 μmol/mL，胎牛血清体积分数为5%，培养14 d。观察初始分离神经干细胞、去除EGF、bFGF培养的细胞及支架材料浸提液与全反式维甲酸预诱导的神经干细胞的细胞形态。⑤诱导分化前后神经干细胞的电生理特性检测：分别选取第3代诱导分化前神经干细胞和④中经全反式维甲酸诱导分化后的神经干细胞。采用Sutter P-97水平拉制仪制作微电极。本实验使用微电极尖端直径为2.5～3.0 μm，阻抗为2～3 MΩ。采用倒置相差显微镜和液压操纵仪进行显微膜片钳细胞操作。先将两种待检测的细胞用人工脑脊液灌流，在灌流前，利用95%O2/5%CO2混合气体对人工脑脊液预先饱和1 h，然后使用电子刺激器产生脉冲电流，通过MEZ-8201微电极放大器向细胞内注入恒定的脉冲电流，利用膜片钳描笔记录仪同时记录静息电位和膜电位。对待检测细胞进行0.6～1.0 nA,310 ms的去极化电流胞内注射，用来诱发动作电位；利用微电极将待测细胞膜电位钳制于-70 mV，用来诱发并记录细胞自发的兴奋性突触后电流。利用膜片钳电位记录仪器通过相关软件收集处理数据。

2结果

2.1明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料形态及孔隙率神经支架材料呈长管状，可根据需要自行调整长度，具有高度仿真性，神经支架材料的横切面上可见材料呈现出多孔结构，纵切面上可见材料内部呈轴向微管结构，相邻的微管之间未见孔隙相互连接(插页Ⅰ图1)，内径261～293(267.0±13.8)μm，孔隙率为84.1%～93.0%、平均90.0%。

2.2明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料的生物相容性初始分离神经干细胞的形态多成圆球状，培养2～3 d后，形成由多个细胞组成的细胞团，细胞团形态不规则，但细胞大小一致，细胞团折光性好。经过传代后，细胞团增大，且形态较为规则。对细胞进行去除EGF及bFGF的培养可发现，细胞贴壁生长，形态不一，出现多个突起。支架材料浸提液与神经干细胞共培养14 d后，神经干细胞出现类似神经细胞的形态改变，胞体呈多角形以及不规则形，有多个突起，呈现出神经元样细胞的表现(插页Ⅰ图2)。实验组、对照组第1天的吸光度值分别为0.29±0.06、0.30±0.04，第5天分别为0.39±0.09、0.40±0.03，第10天分别为0.69±0.05、0.58±0.06，第14天分别为0.87±0.07、0.64±0.07，两组第10、14天时比较，P均<0.05。两组细胞的吸光度值随培养时间的延长而增大。支架材料浸提液与全反式维甲酸预诱导的神经干细胞共培养14 d后，支架材料的表面及空隙内可见较多细胞生长，细胞胞体发出多个突起，胞体呈多角形以及不规则形，有多个突起，突起相互连接，使细胞交织成网状，表现出类神经元样细胞的改变，支架材料对细胞无明显生物学影响，在全反式维甲酸诱导下可促进神经干细胞向类神经元细胞分化，具有良好的细胞相容性。神经干细胞诱导分化前、后静息电位分别为(-28.99±5.08)、(-57.88±7.09)mV，膜电位分别为(18.09±1.09)、(36.80±5.03)pF，诱导分化前、后比较，P均<0.01。详见图1、2。

注：左上图示诱导分化成神经元样细胞产生的动作电位；右上图示神经干细胞不产生动作电位；下图示神经元样细胞钳制在-40 mV时去极化,产生大量的动作电位。

图1细胞的动作电位

注：a、b线示神经干细胞无自发的兴奋性突触后电流；c、d线示诱导分化成神经元样细胞会产生自发的兴奋性突触后电流，但与正常的神经元相比，其电流频率低、幅度稍小；e、f线示典型神经元的自发的兴奋性突触后电流,电流频率高、幅度大。

图2膜片钳记录的细胞的兴奋性突触后电位

3讨论

目前，脊髓损伤缺乏良好治疗方法。中国每年有大量因事故导致的脊髓损伤患者，且以胸腰段脊髓损伤为主[6],组织工程学研究为解决这一问题提供了新思路。研究人员从工程支架材料入手，研究了一系列适合制作支架的材料[7,8]，如水凝胶、聚丙烯等。明胶和壳聚糖也是其中研究较为深入的两种材料[9～10]，两者来源广泛，价格低廉，具有较好的生物相容性，壳聚糖可降解，还具有抗菌防腐和成膜性的特性。本实验选用传统的冷淋技术，将两种材料的混合液处理后，制得的材料在扫描电镜成像中显示，材料的纵切面呈现长微管状，微管之间彼此不相连，这为将来神经元轴突以及突起相互连接提供了良好的结构基础，且不易使神经元横向生长，抑制了瘢痕组织横向愈合，提供了天然的结构屏蔽作用。测量支架材料的孔隙率结果显示，种子细胞可以大量“居住”在支架材料的天然空隙中，这为有效发挥种子细胞的修复作用提供了客观的可能。此外，为有效修复损伤的脊髓，研究人员将神经营养因子以及干细胞复合到支架材料上，使一个载体搭载多种修复机制，最大限度发挥组织工程材料的优势。其中神经营养素3被发现具有较好的营养细胞、促进神经元存活、维持其活性的作用，并可有效促使轴突延伸并再生[11]。此为支架材料有效发挥复合的神经营养素3的作用，提供了可靠的实验依据。

在干细胞研究方面，研究较多的有神经干细胞、骨髓间充质干细胞等[12～14],本实验选用神经干细胞，其在全反式维甲酸诱导下容易向神经元样细胞分化[15]。维甲酸具有较强的诱导性能，并在胚胎发育以及维持机体正常功能方面发挥重要作用[16]。本实验按照既往的实验方法获得神经干细胞，并在全反式维甲酸的诱导下与支架材料浸提液及共培养后发现，支架材料本身对神经干细胞无生物学影响，且随着时间的推移，能够有效维持并加强干细胞的活性；在维甲酸的诱导下，神经干细胞能够向神经元样细胞分化，并分别从细胞形态以及细胞电生理特性得到证实。在细胞形态上，发现经过诱导分化后的神经干细胞具有类神经元的形态改变。电生理检测中发现，神经干细胞和经过全反式维甲酸诱导分化后的神经元样细胞，两者的膜电位和静息电位出现显著差别，后者更加接近成熟的神经元细胞的电生理特征[17]，与既往其他研究结果一致，从电生理方面证实了本实验诱导分化的有效性。神经元样细胞被诱导出动作电位,而未诱导分化的神经干细胞不能诱发动作电位,这进一步证实了神经元样细胞具有与神经元类似的活性。此外，神经元样细胞上发现自发的兴奋性突触后电位，与成熟的神经元表现相似，但两者频率和幅度有一定的差别。

综上所述，本研究成功构建了明胶—壳聚糖复合神经营养素3神经支架材料，其与神经干细胞之间的生物相容性良好，这为未来利用组织工程复合神经营养因子、种子细胞，进而治疗脊髓损伤奠定了较好的基础。

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Establishment of gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffold and its biocompatibility

QINLi-na

(ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Abstract:ObjectiveTo fabricate the gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffolds and to determine its biocompatibility. MethodsWe mixed the gelatin and chitosan solutions, then added a trace of neurotrophin-3. After making the injection mold, we fabricated the nerve guidance scaffolds by the freeze-drying technique. Then the characteristics of the scaffold were observed by scanning electron microscope morphology, and the scaffold diameter, porosity, etc were detected. We extracted the gelatin chitosan composite neurotrophin-3 nerve scaffold material extracts, and then we observed the effects on the growth and differentiation of neural stem cells; the electrophysiological properties of the differentiated cells were observed by the patch-clamp technique. ResultsThe inside diameter of gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffold was (267.0±13.8) μm and porosity was 90.0%. Scanning electron microscopy showed that neural stem cells grew well on the scaffold. Under the induction of retinoic acid, neural stem cells differentiated into neuron-like cells, and showed structural of synaptic connections between neurons initially. What′s more, the cells differentiated were detected the neuron-like cell electrophysiological properties by the patch-clamp technique. Conclusion The gelatin-chitosan composite neurotrophin-3 nerve scaffolds were successfully constructed, and had good biocompatibility with neural stem cells.

Key words:spinal cord injuries; scaffold materials; neurotrophin-3; retinoic acid; neural stem cells

(收稿日期：2014-11-12)

作者简介：秦丽娜(1978-)，女，博士，讲师，主要研究方向为干细胞治疗神经损伤。E-mail:qinglina20088@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31200737)；广东省医学科研基金立项课题(B2012080)。

中图分类号：R318

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)07-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.001