丁红，黄维义，沈桂冬

(1泸州医学院附属医院，四川泸州 646000；2安康市中心医院)

姜黄素对人脐静脉血来源内皮祖细胞HO-1表达的影响及机制探讨

丁红1，2，黄维义1，沈桂冬2

(1泸州医学院附属医院，四川泸州 646000；2安康市中心医院)

摘要：目的观察姜黄素(CMN)对人脐静脉血来源内皮祖细胞(EPCs)血红素氧合酶1(HO-1)蛋白表达的影响，并探讨其机制。方法采用密度梯度离心法体外分离、培养人脐静脉血单个核细胞，以免疫荧光法观察细胞吸收Dil-ac-LDL和FITC-UAE-1情况并同时进行CD133免疫荧光鉴定EPCs。将EPCs分为0、5、10、15 μmol/L CMN组，分别以终浓度为0、5、10、15 μmol/L CMN的培养基孵育24 h，检测各组HO-1蛋白表达、细胞增殖能力及培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力。将EPCs分为单纯组、CMN组、CMN+ATRA组，分别在单纯培养基、加15 μmol/L CMN的培养基、加15 μmol/L CMN+1 μmol/L ATRA的培养基中孵育24 h，检测各组HO-1蛋白表达。结果 从脐静脉血分离出来的单核细胞培养3～4 d开始贴壁，7 d后有一定方向性，呈簇状生长，免疫荧光检测显示CD133表面标记阳性率及DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性率均>90%。随CMN浓度升高，EPCs的HO-1蛋白表达逐渐升高(P均<0.05)，细胞增殖能力逐渐增强(P均<0.05)，细胞培养液中LDH活力则无明显改变(P均>0.05)。与单纯组比较，CMN组、CMN+ATRA组HO-1蛋白表达量增加(P均<0.05)，且后两组比较，P<0.05。结论CMN可诱导人脐静脉血来源EPCs高表达HO-1蛋白，这可能与Nrf2/ARE信号途径有关。

关键词：姜黄素；血红素氧合酶1；内皮祖细胞

内皮祖细胞(EPCs)是成熟内皮细胞的前体细胞，具有增殖、迁移、分化为成熟内皮细胞和聚集形成新生血管的作用，主要参与胚胎时期的血管生成，也广泛参与成人的血管修复与再生。循环中EPCs的数量与功能决定着损伤血管的内皮修复程度，可作为评估内皮功能及独立预测动脉粥样硬化病程和冠心病患者预后的指标[1]。血红素氧合酶1(HO-1)是细胞内的一种可诱导的重要保护酶，在调节细胞周期、应对炎症与氧化应激损伤中均发挥着不可或缺的作用[2]。已有研究[3,4]显示，人为上调HO-1表达可增加循环中EPCs的数量与功能，显著增强对损伤血管的修复并促进缺血梗死区血管新生，从而改善包括冠心病在内的动脉粥样硬化患者的预后。近年发现一种天然的植物药用成分姜黄素(CMN)，其是HO-1的强诱导剂，抗炎、抗氧化损伤与组织细胞保护作用均有赖于其对HO-1蛋白的诱导表达。本实验观察了CMN对人脐静脉血来源EPCs中HO-1表达的影响，并探讨其可能的机制。

1材料与方法

1.1主要试剂CMN、全反式视磺酸(ATRA)购自美国Sigma公司；硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素1(FITC-UAE-1)、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和鼠抗人CD133抗体购自R&D SYSTEMS公司；兔抗HO-1抗体(ab13243)购自abcam公司；二抗购自江苏碧云天生物公司；CCK-8购自碧云天生物研究所；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；新生儿脐静脉血采集于泸州医学院附属医院产科足月剖宫产健康产妇，采集标本均经患者及家属同意。

1.2方法

1.2.1主要试剂配制CMN配制:取CMN(相对分子质量368.37)3.683 mg溶于100 μL DMSO中即得到200 μmol/L的标准液，4 ℃冰箱内保存备用。ATRA配制：取10 mg ATRA(相对分子质量300.4)溶于3 329 μL DMSO中即得到10 mol/L的标准液，-20 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2人脐静脉血中单个核细胞的分离、培养及EPCs的鉴定将人脐静脉血分离获得单个核细胞后制成重悬细胞，调整细胞密度为4×106/mL后接种于完全培养基的纤连蛋白包板的培养瓶中，置37 ℃、5%CO2、95%湿度恒温孵育箱中静置培养。培养至第7天，进一步用PBS洗掉非贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。倒置相差显微镜下观察细胞形态，24 h后可见少量细胞贴壁，主要是成纤维细胞，悬浮细胞继续培养72～96 h时，细胞开始大量贴壁，细胞形态由圆形变为椭圆形并出现集落样生长倾向；第7天梭形细胞增多，细胞生长有一定方向性。培养第7天的细胞CD133免疫荧光检测呈绿色，阳性率达90%以上。取培养第9天的细胞制作爬片，先后加入内皮细胞特异性抗体FITC-UAE-1、Dil-ac-LDL孵育，荧光显微镜观察见双染的黄色细胞达90%以上。

1.2.3EPCs分组及处理实验一：将EPCs分为0、5、10、15 μmol/L CMN组，分别以终浓度为0、5、10、15 μmol/L CMN的培养基孵育24 h；实验二：将EPCs分为单纯组、CMN组、CMN+ATRA组，分别在单纯培养基、加15 μmol/L CMN的培养基、加15 μmol/L CMN+1 μmol/L ATRA的培养基中孵育24 h。

1.2.4各组EPCs中HO-1蛋白检测采用Western blotting法。收集实验一及实验二各组细胞，加入裂解液裂解60 min，4 ℃、14 000 r/min离心5 min，取上清液以BCA法检测蛋白浓度。80 V恒压SDS-PAGE电泳，待蛋白样品到达浓缩胶与分离胶交界处时换用150 V继续电泳，后转移至PVDF膜上，TBST液封闭洗涤，以1∶200一抗稀释液4 ℃孵育过夜，以1∶2 000二抗稀释液室温下孵育1 h，在PVDF膜上均匀地涂抹化学发光底物，弃发光液，以一层保鲜膜轻轻覆盖在PVDF膜上，在暗室内将X线片置于其上，放入暗盒中曝光5 min，在凝胶成像系统中成像。以β-actin为内参，采用Quantity One图像分析软件分析其相对表达量。

1.2.5CMN对EPCs毒性及细胞增殖的影响取实验一中各组上清液，按检测试剂盒说明书方法检测LDH活力。收集实验一中各组细胞，按CCK-8检测试剂盒说明书方法检测细胞增殖能力。

2结果

2.1CMN对EPCs HO-1蛋白表达的影响检测结果0、5、10、15 μmol/L CMN组HO-1光密度比值分别为0.65±0.02、0.87±0.08、1.25±0.05、1.34±0.03，EPCs的HO-1蛋白表达量随CMN浓度的升高而逐渐增加(P均<0.05)。单纯组、CMN组、CMN+ATRA组HO-1光密度比值分别为0.47±0.04、1.43±0.02、1.11±0.05，与单纯组比较，CMN组、CMN+ATRA组HO-1表达量增加(P均<0.05)，且后两组比较，P<0.05。

2.2CMN对EPCs毒性及细胞增殖的影响CMN对EPCs无明显毒性损伤作用；CMN浓度越高，EPCs增殖活力越强。详见表1。

注：与0 μmol/L CMN组比较，*P<0.05；与5 μmol/L CMN组比较，$P<0.05；与10 μmol/L CMN组比较，#P<0.05。

3讨论

CMN是从姜黄、郁金等植物根茎中提取的一种生物多酚化合物。传统医学认为其具有破瘀、行气、消积和通经止痛的功效。现代药理学研究[2]显示，CMN具有抗炎、抗氧化、抑制动脉粥样硬化、抗病毒等作用。WHO/FAD已允许将其作为天然调味剂及食用色素使用，近年被广泛用于化妆品及炎症治疗。研究[5,6]已证实CMN能诱导多种细胞高表达HO-1蛋白。本实验结果表明，CMN能诱导EPCs表达HO-1蛋白，且在0~15 μmol/L范围内具有剂量依赖性。HO-1广泛分布于哺乳动物各种组织细胞的微粒体内，生理状态下只有少量表达，病理状态下表达增多。近年有研究报道，一些本不具有致氧化应激作用的生物黄酮类物质也能通过特定的细胞内信号途径诱导HO-1表达。本研究小组也曾报道银杏黄酮能通过TPK(酪氨酸蛋白激酶)信号途径诱导大鼠主动脉平滑肌细胞内HO-1显著表达[7]。已知核因子E2相关因子2(Nrf2)是一个具有碱性亮氨酸拉链蛋白家族的重要细胞保护性转录因子，可在各种细胞内表达并与DNA的NF-E2区结合，而NF-E2区包含有抗氧化反应元件(ARE)序列(GTGACTCAGCA)。ARE是许多抗氧化酶/蛋白基因上游中的顺式作用增强元件，Nrf2则参与对ARE的调节，从而在ARE介导的抗氧化基因表达中起重要作用。Nrf2/ARE信号通路能激活其下游的保护性蛋白HO-1表达。生理状态下Nrf2与胞质蛋白伴侣分子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keapl)结合，其活性处于相对抑制状态，在半胱氨酸残基发生氧化的情况下，Nrf2与Keapl解耦连后转移入核，与ARE结合，启动ARE调控的抗氧化酶基因如HO-1表达[8]。研究[9]发现，ATRA主要通过激活视磺酸(RA)的α受体，减少核中的Nrf2与ARE结合，从而特异性抑制Nrf2-ARE的形成，致使包括HO-1在内的抗氧化酶基因表达减少。尹闻科等[5]报道，CMN能通过Nrf2/ARE信号通路上调SH-SY5Y细胞中HO-1表达。本实验结果表明CMN也是通过Nrf2/ARE信号通路诱导EPCs中的HO-1表达。但所加用的ATRA并没有完全阻断HO-1的表达，其原因可能是ATRA的用量不足以达到完全阻断的效果，也可能是CMN诱导HO-1表达还存在其他的细胞内信号机制，需要进一步的实验证实。

本实验还监测了CMN对EPCs可能存在的毒性作用。LDH是催化乳酸和丙酮酸相互转换的酶，广泛存在于所有组织细胞中，在细胞损伤时释放，且释放量与细胞损伤程度呈正比，定量测定培养液中LDH活性即可作为细胞损伤程度的一种敏感且简便的指标。本实验发现随CMN浓度升高，细胞增殖活力逐渐增强，而LDH活力却没有出现明显升高，在5 μmol/L CMN时反而降低，这可能与我们的实验误差有关，但LDH的这种变化并没有达到统计学差异，表明CMN对EPCs没有细胞毒性，并能促进细胞的增殖活力。

参考文献：

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Effect of curcumin on HO-1 expression in endothelial progenitor cells from human umbilical vein blood

DINGHong1,HUANGWei-yi,SHENGui-dong

(1TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of curcumin (CMN) on the HO-1 protein expression in endothelial progenitor cells (EPCs) from human umbilical vein blood and to investigate the mechanisms. MethodsThe mononuclear cells were isolated and cultured by density gradient centrifugation from human umbilical vein blood. The morphology of EPCs was observed with inverted microscope，EPCs were also identified as adherent cells which were double positive for Dil-ac-LDL/FITC- UAE-1 by immumofluorescence method, and their expression of CD133was detected. EPCs were divided into four groups and incubated with 0, 5, 10 and 15 μmol/L CMN respectively for 24 h. Then the HO-1 protein expression, the cell proliferation activity and the Lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant were detected. EPCs were divided into three groups and incubated with 0 μmol/L CMN (simple group), 15 μmol/L CMN (CMN group) and 15 μmol/L CMN+1 μmol/L all-trans retinoic acid (ATRA) (CMN+ATRA group) respectively for 24 h. The HO-1 protein expression was detected. ResultsAttached cells were observed after 3-4 days and cluster growth was noticed after 7 days. The immunofluorescence showed that the positive rate of CD133, the double staining positive rates of DiI-acLDL and FITC-UEA-1 were all more than 90%. With the increase of CMN concentration, the expression of HO-1 protein in the EPCs increased gradually (all P<0.05), and the cell proliferation increased significantly (all P<0.05), but the LDH activity in the supernatant did not change obviously (all P>0.05). Compared with simple medium group, the expression of HO-1 protein in the CMN and CMN+ATRA group increased (all P<0.05), and significant difference was found between the CMN and CMN+ATRA groups (P<0.05). ConclusionCMN may effectively induce the high protein expression of HO-1 in EPCs, which is related with Nrf2/ARE signal pathway.

Key words:curcumin; heme oxygenase-1; endothelial progenitor cells

(收稿日期：2014-11-26)

通信作者简介：黄维义(1968-)，男，主任医师，教授，研究方向为心脏介入治疗。E-mail:hwy6881@126.com

作者简介：第一丁红(1979-)，男，主治医师，研究方向为心脏介入治疗。E-mail:dinghongyisheng@163.com

基金项目：泸州市人民政府—泸州医学院科技战略合作科技项目(2013LZLY-J15)。

中图分类号：R329.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)07-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.006