★　谢一辉第一作者：谢一辉(958—),男，教授，硕士生导师。研究方向：中药活性成分分析。E-mail:436985@qq.com。　丁妍华　练波　余斌　樊浩通信作者：樊浩(980—)男，副教授，博士。研究方向：中药现代鉴定技术、生物传感器。E-mail:05095500@qq.com。　(.江西中医药大学　南昌 330004；.江西省化学工业学校　南昌 3300)

覆盆子活性成分山奈酚的含量测定*

★谢一辉1*第一作者：谢一辉(1958—),男，教授，硕士生导师。研究方向：中药活性成分分析。E-mail:243619851@qq.com。丁妍华1练波1余斌2樊浩1*通信作者：樊浩(1980—)男，副教授，博士。研究方向：中药现代鉴定技术、生物传感器。E-mail:105095500@qq.com。(1.江西中医药大学南昌 330004；2.江西省化学工业学校南昌 330012)

摘要：目的：建立覆盆子改善肾阳虚型痴呆活性成分山奈酚的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-0.1%磷酸水(30∶70)，流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长 266nm，进样量20μL。结果:山奈酚质量在0.0782～5.000μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999)，平均加样回收率为99.50%，RSD=2.1%。 结论:试验方法简便、快速、实验结果准确可靠，该方法可作为覆盆子有效成分山奈酚含量测定的方法。

关键词：覆盆子；高效液相色谱法；山奈酚；老年痴呆

覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子RubuschingiiHu近成熟的果实。性微温、味甘、酸，归肝、肾经，具补肝益肾、固精缩尿、明目之功效，许多抗衰古方中含有覆盆子。据现代药理研究，覆盆子具有改善学习记忆能力、延缓衰老[1]、抗诱变[2]、促进淋巴细胞增殖、温肾助阳等作用，其含有多种抗氧化、调节免疫功能和调整物质代谢等作用的成分[3]。

课题组前期研究表明：覆盆子以及覆盆子有效组分可显著地改善肾阳虚型痴呆大鼠在morris水迷宫中的定位航行与空间探索能力，有效地保护肾阳虚痴呆动物的海马CA1区神经元使其免受损伤，明显减少细胞tau蛋白异常表达[4]，起到改善肾阳虚型痴呆大鼠学习记忆能力[5-6]，改善肾阳虚型痴呆等功效较为显著。研究表明覆盆子有效成分为乙酸乙酯部位中黄酮类成分，而山奈酚是覆盆子黄酮中含量最高、活性最强的活性成分[7]。从覆盆子中提取的单体成分进行神经细胞保护实验显示，山奈酚显著性保护神经细胞免受H2O2的损伤，而且在所有单体成分中活性最高。后期将进行覆盆子活性成分防治老年肾阳虚型痴呆的作用机制和组分配伍研究。为保证后续研究的实验结果真实、可靠、稳定，必须要求覆盆子药材所含量成分，特别是最主要的活性成分山奈酚含量稳定。有必要建立覆盆子活性成分山奈酚的含量测定方法。对覆盆子质量进行科学准确评价，有利于后续对覆盆子进行深入研究，也有利于临床用药的安全有效。

1仪器与材料

Agilent 1200高效液相色谱仪；Sartorius BS214-D天平(万分之一)；Mettler AE240天平(十万分之一)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；GZX-9146MBE型数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；自动三重蒸馏水器(上海亚荣生化仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；RE-52旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)；Du-650紫外可见光谱仪(美国贝克曼公司)。

山奈酚对照品(自提，PHLC归一化纯度为：99.59%)；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。覆盆子药材购于樟树、九江、湖南等地，经刘庆华老师鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子RubuschingiiHu近成熟的果实。

2方法与结果

2.1色谱条件及系统适应性试验色谱柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸水(30∶70)，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长 266nm，进样量：20μL。在上述色谱条件下，理论塔板数按山奈酚计算不低6 000, 山奈酚与相邻组分峰的分离度均大于1.5。色谱图见图1-2。

图1　覆盆子样品HPLC图

图2　山奈酚对照品HPLC图

2.2对照品溶液的制备称取山奈酚对照品约10mg，精密称定。置于10mL容量瓶中，用甲醇溶液，并稀释至刻度线，摇匀，配制成1 mg/mL。

2.3供试品溶液的制备精密称取覆盆子粉末约2g，精密称定。加甲醇60mL于水浴回流1h,放冷至室温，滤过，滤液于蒸发皿中蒸干，精密加入甲醇2mL, 称重，水浴加热使残渣溶解，放冷，加甲醇补足重量，即得。

2.4线性关系的考察取上述对照品液，配制成9个不同浓度的山奈酚对照品液，含量分别是：1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91 μg/mL。取上述对照品液各20μL，按2.1色谱条件测定各对照液的峰面积。以对照品重量为横坐标，其色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到山奈酚回归方程式为：Y=2618.05X-50.625，r=0.9999，结果表明山奈酚在0.0782～5.000μg范围内呈良好的线性关系。

2.5精密度试验精密吸取同一对照品溶液，按2.1色谱条件测定，每次进样20μL，连续进样6针，测定山奈酚峰面积值，峰面积RSD为1.7%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验取覆盆子粉末6份，每份约2g，精密称定。按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定。结果显示：山奈酚平均含量约为20μg/g，RSD值为0.86%(n=6)，表明该法重复性好。

2.7稳定性试验取供试品品溶液，常温放置，分别于0,2,4,8,12,24h，按2.1色谱条件测定，记录色谱峰面积，计算出山奈酚的含量，RSD=2.3%，表明供试品溶液中山奈酚在24h内保持稳定。

表1　加样回收试验结果

2.1%(n=9)，结果见表1。

2.9样品含量测定取5个产地的了覆盆子药材细粉各约2 g，精密称定。按2.3条件制备供试溶液, 按2.1条色谱条件进样分析, 计算山奈酚的含量, 结果见表2。

表2　不同产地覆盆子的含量测定结果

3讨论

3.1检测波长的选择取山奈酚对照品溶液在190～500nm范围内进行紫外波长扫描，山奈酚在266nm处有最大吸收，故选266nm作为检测波长。

3.2流动相考察比较了不同酸碱性的流动相，结果显示采用酸性流动相, 可有效提高柱效, 改善峰形，减少山奈酚的色谱峰拖尾现象, 而其中以0.1%磷酸水溶液的分离效果最佳。比较了不同配比和不同酸度的甲醇水、甲醇酸水、乙腈水和乙腈酸水，结果显示乙腈∶0.1%磷酸= 30∶70所组成的流动相分离效果最佳。

3.3供试品溶液制备方法的选择考察了甲醇超声、索氏提取、乙醇回流和甲醇回流4种提取方法，结果表明甲醇回流山奈酚含量最高，杂质峰相对较少。曾试用硅胶柱、反相填料柱、聚酰胺柱、硅藻土的预处理甲醇回流液，以除去提取液的杂质，因经上述处理后，山奈酚易损失，故直接将回流液浓缩定容后测定。

参考文献

[1]李天傲,谭喜莹.HPLC测定覆盆子中没食子酸含量[J].中国现代应用药学,2008,25(3)；235-237.

[2]付德润,钟承民,郭伟,等.覆盆子抗诱变作用的实验研究[J].中国全科医学杂志,1998 ,1 (1) :35.

[3]佟丽华.覆盆子的化学成份研究[J].佳木斯医学院学报，1994，17 (2)：51.

[4]Niering P,Michels G,Watjen W, et al，Protective and Detrimental Effects of Kaemperol in Rat H4 IE Cell:Implication of Oxidative Stress and Apoptosi[J].Toxicol Appl Pharmacol，2005，209(2):114-122.

[5]黄丽萍,熊玉洁,赵梦岚,等.覆盆子有效部位改善肾阳虚型痴呆大鼠学习记忆作用机制研究[J].中国实验方剂学杂志，2013,19(19)：192-196.

[6]黄丽萍,熊玉洁,赵梦岚,等.覆盆子对肾阳虚型DA大鼠学习记忆的影响[J].中药药理与临床,2013，29(4)：111-113.

[7]黄丽萍,熊玉洁,赵梦岚,等.覆盆子不同萃取部位对东莨菪碱所致学习记忆障碍大鼠的影响[J].时珍国医国药,2013,24(9)：

2 083-2 084.

Quantitative Determination of Active Ingredient Kaempferol inRubusChingiiHu

XIE Yi-hui1,DING Yan-hua1,LIAN Bo1,YU Bin2,FAN Hao1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

2.JiangxiChemicalIndustrySchool，Nanchang330012,China.

Abstract:Objective: To establish method for the quantitative determination of anti-aging active ingredient kaempferol in Rubus Chingii Hu. Methods: Using high performance liquid chromatography. The column was Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm),mobile phase: acetonitrile-0.1% phosphoric acid in water (30∶70),flow rate: 1mL/min, column temperature:30℃, detection wavelength:266nm, the injection volume:20μL.Results: The quality of Kaempferol ranged from 0.0782μg to 5.000μg. Peak area showed a good linear relationship (r=0.9999) and the average sample recovery rate was 99.50%, RSD=2.1%.Conclusion: The method is simple, rapid and accurate, which can be used as an effective method for the quantitative determination of anti-aging active ingredient kaempferol in Rubus Chingii Hu.

Key words:Rubus Chingii Hu；PHLC；Kaempferol；Senile Dementia

收稿日期：(2014-11-10)编辑：曾文雪

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

基金项目：*江西省自然科学 (20142BAB205025)；江西中医药大学“道地药材及特色中药资源研究专项”。