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山苓祛斑凝胶剂提取物质量标准研究

2016-12-26陈军舒祥余南才

中国民族民间医药·上半月 2016年11期
关键词:含量测定高效液相色谱法

陈军++舒祥++余南才

【摘要】目的:建立山苓祛斑凝胶的质量标准。方法:运用HPLC法测定祛斑凝胶提取物中尿囊素、阿魏酸含量作为评价指标,流动相分别为乙腈-0085%磷酸-水(5∶95)、(17∶83),流速为05mL/min、1mL/min,柱温30℃,检测波长为224nm、316nm。结果:尿囊素、阿魏酸线性范围0368~2208μg、0424~2544μg,精密度RSD 055%、092%,稳定性RSD 14%、15%,重复性RSD 095%、055%。祛斑凝胶剂中尿囊素、阿魏酸含量分别为112mg/g、45mg/g。结论:该方法重复性好,质量可控,可为该凝胶制剂进行中试、生产提供参考。

【关键词】山苓祛斑凝胶;含量测定;高效液相色谱法

【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2016)21-0011-03

黄褐斑也称“肝斑”、“蝴蝶斑”,为面部黄褐色色素沉着,且多对称蝶形分布于颊部,大小不一、形态不定,好发于育龄期女性[1]。黄褐斑由多种因素综合作用导致,其发病与妊娠、长期口服避孕药、月经紊乱有关,血中雌激素水平高是主要原因。目前,尚无彻底治愈方法,临床治疗方法有一定的副作用,如造成外源性褐黄病、皮肤萎缩、永久性脱色,甚至出现肾毒性、精神、神经症状等,因而黄褐斑一直是医学界关注的问题。中医药治疗黄褐斑有着悠久历史,具有一定优势。中药凝胶剂是一种新型外用制剂,适用于皮肤、黏膜及腔道,不仅避免口服给药存在的胃肠道内酶、酸等首过作用,而且可减轻药物不良反应,同时具有使用方便、舒适、生物相容性好等多种优点,临床上治疗黄褐斑已取得较好疗效[2-4]。复方中药山苓祛斑方为我院中医部周利副主任医师经验方,由山药、茯苓、白芷、白及、当归等药组成。研究以尿囊素、阿魏酸含量作为凝胶剂质量标准[5-6],用HPLC法测定凝胶剂中尿囊素、阿魏酸含量,为其质量控制提供实验依据。

1仪器与材料

1.1仪器DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色谱仪(紫外DAD检测器,美国DIONEX公司);CP 2104 电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。

1.2材料山药、茯苓、当归等9味中药材饮片(亳州国一堂中药饮片有限公司),祛斑凝胶剂(批号:20150401、20150405、20150410,自制);凝胶剂阴性样品(自制不含当归及山药的样品各一份,批号20150410),尿囊素(批号:111501-200001)、阿魏酸对照品(批号:110773-200611)、茯苓(批号:121117-201302)、当归(批号:120927-201408)、山药(批号:121137-201405)等对照药材购于中检所,乙腈为色谱纯,其余试剂为分析纯。

2方法

2.1祛斑凝胶提取物中尿囊素含量测定

2.1.1色谱条件ODS C18色谱柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.085%磷酸水(5∶95);流速:0.5mL/min;柱温:30℃;检测波长:224nm;进样量:10μL。

2.1.2对照品溶液制备精密称取尿囊素对照品9.2mg,置50mL量瓶中,用超纯水稀释至刻度。

2.1.3供试品溶液制备称取山苓祛斑凝胶提取物3g,加入适量甲醇超声溶解,加入100-200目硅胶4.5g,蒸干溶剂后进行硅胶柱色谱分离。硅胶用量为50g (300~400目),洗脱剂选择二氯甲烷∶甲醇(9∶1),收集200mL,浓缩后用甲醇稀释至10mL,作为供试品溶液。

2.1.4阴性对照溶液制备按处方量制备除山药外的所有组分的凝胶剂,作为山药阴性对照样品,余同“2.1.3”操作,即得。

2.1.5线性关系考察分别进样2、4、6、8、10、12μL以尿囊素含量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,进行线性回归,得回归方程y=9.0814x+0.0354,R2=0.9998,表明尿囊素在0.368~2.208μg线性关系良好。

2.1.6精密度试验精密吸取供试品溶液10μL,连续进样6次,记录峰面积积分值,结果表明:精密度良好,平均峰面积为15.5925,RSD为0.55%。

2.1.7稳定性试验精密吸取尿囊素标准品溶液10μL,按0、4h、8h、12h、16h、24h 进样1次,记录峰面积积分值,结果表明:尿囊素标准品稳定性良好,RSD为1.4%。

2.1.8重复性试验取同一批凝胶剂6份,按尿囊素供试品制备方法制备供试品溶液,按“2.1.1”色谱条件进样6次,计算尿囊素平均含量为4.5mg/g,RSD为0.95%,表明该方法重复性良好。

2.1.9加样回收率试验称取山苓祛斑凝胶提取物1.5g,分别加入尿囊素对照品溶液15μL,按照供试品溶液制备的方法处理,进样10μL,记录峰面积积分值,代入回归方程,计算尿囊素标准品的加样回收率为97.2%,RSD为1.2%。

2.1.10尿囊素含量测定精密吸取供试品溶液10μL,液相色谱仪,记录峰面积积分值,代入回归方程,计算得出尿囊素含量为4.5mg/g。

2.2山苓祛斑凝胶提取物中阿魏酸含量测定

2.2.1色谱条件ODS C18色谱柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-水(17:83);流速:1mL/min;柱温:35℃;检测波长:316nm,进样量:10μL。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取阿魏酸对照品,加甲醇制备成浓度为0.212μg/μL的溶液。

2.2.3供试品溶液的制备取山苓祛斑凝胶提取物10g,加甲醇超声,并定容至50mL容量瓶中。

2.2.4阴性对照溶液制备按处方量制备除当归外的所有组分的凝胶剂,作为当归阴性对照样品,余同“2.2.3”操作,即得。

2.2.5线性范围考察分别精密吸取阿魏酸对照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色谱仪,测定峰面积,以峰面积和进样量求得回归方程y=1.2937x +0.3404, R2=0. 9996,表明在0.424~2.544μg有良好线性关系。

2.2.6精密度实验精密吸取对照品溶液10μL,重复进样6次,测得峰面积,其RSD为0.92%,表明仪器精密度良好。

2.2.7稳定性试验精密吸取阿魏酸标准品溶液10μL,按0、4、8、12、16、24h 进样1次,记录峰面积积分值,结果表明:阿魏酸标准品稳定性良好,RSD为1.5%。

2.2.8重复性试验取同一批凝胶剂6份,按阿魏酸供试品制备方法制备供试品溶液,按“2.2.1”色谱条件进样6次,计算阿魏酸平均含量为11.4mg/g,RSD为0.55%,表明该方法重复性良好。

2.2.9加样回收率实验精密量取两份1mL样品溶液:向其中一份精密添加阿魏酸对照品溶液,定容至50mL,测得平均回收率为96.8%,RSD为1.56%。

2.2.10阿魏酸含量测定精密吸取供试品溶液10μL,液相色谱仪,记录峰面积积分值,代入回归方程,计算得出阿魏酸含量为11.2mg/g。

2.3山苓祛斑凝胶剂TLC定性鉴别按2015版《中国药典》一部及附录(0502)薄层色谱法对祛斑凝胶剂中山药、当归及茯苓进行TLC定性鉴别[7],供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性无干扰。

按文献[8]对山苓祛斑凝胶剂中的尿囊素进行薄层鉴定:取山苓祛斑凝胶剂10g,加入适量甲醇超声溶解,溶解后吸取10μL点于硅胶GF254板,以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶甲醇(1∶8∶1∶1∶2)为展开剂,15%的对二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液为显色剂。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同黄绿色斑点,且阴性样品无干扰。

3讨论

3.1波长选择经紫外光谱扫描,测得尿囊素在224nm处有最大吸收,阿魏酸在316nm处有最大吸收,故本文分别选择224nm作为尿囊素的检测波长,316nm作为阿魏酸的检测波长。

3.2流动相的选择原有用甲醇-水(1∶9)测定尿囊素含量,实验发现其分离效果不好,分离度不能达到分析要求;甲醇

-磷酸二氢钾缓冲液(2∶98)比例的极性太大,而纯水对色谱柱的损害较大。经摸索最后采用乙腈-0.085%磷酸-水

(5∶95) 作为流动相,基本能够达到较好的分离效果,尿囊素出峰时间大约在5.5min左右。重复性试验RSD为0.95%,加样回收试验测得平均回收率为96.8%,RSD为1.56%也表明在此色谱条件下尿囊素的分离效果较为满意。

研究通过测定山苓凝胶剂中尿囊素和阿魏酸的含量,初步确定了山苓凝胶剂的质量控制方法。所建立的方法简单,准确,分离度与重现性均好,可以用于控制山苓凝胶剂的质量。

参考文献

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康金森,王雪飞,刘发,等.红玉祛斑胶囊对黄褐斑模型小鼠的影响[J].中药药理与临床,2013,29(4):134-136.

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[3]杨宏莉,李少春,张伟伟,等.山药多糖的药理作用[J].医学研究与教育,2010,27(3):80-82.

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[5]王海波,蔡宝昌.反相高效液相色谱法测定不同产地山药中尿囊素的含量[J].中药新药与临床药理,2004,15(3):190-192.

[6]胡杰,冯丽莉,崔福德.当归川芎中阿魏酸提取的研究[J].时珍国医国药,2004,15(11):732-733.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:57-58.

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(编辑:陶希睿)

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