★　刘建群　王雪梅　张国华　舒积成　张锐　(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室　南昌 330004)

雷公藤甲素体内代谢产物研究*

★刘建群*第一作者：刘建群(1970—)，男，博士，教授。研究方向：中药活性成分及质量评价。Tel: (0791)87119027，E-mail: liu5308@sina.com。王雪梅张国华舒积成张锐(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室南昌 330004)

摘要：目的：研究配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠体内的代谢产物，为阐明甘草对雷公藤的减毒增效机制以及指导雷公藤甲素代谢产物的分离鉴定奠定基础。方法：采用高效液相色谱二极管阵列结合电喷雾离子肼多级质谱(HPLC-DAD-ESI/Trap/MSn)法研究配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠尿液中的代谢产物。结果：在大鼠尿液中发现雷公藤甲素代谢产物4个，分子量分别为376(M1)，376(M2)，374(M3)和390(M4)。根据DAD紫外光谱图、电喷雾离子肼多级质谱以及药物体内代谢特点初步鉴定为：2(或5)-羟基雷公藤甲素(M1，M2)，2-羰基雷公藤甲素(M3)，2-羰基-5-羟基雷公藤甲素(M4)。结论：氧化代谢产物为雷公藤甲素的主要代谢产物，氧化代谢可能为雷公藤甲素的解毒途径。

关键词：雷公藤甲素；甘草；代谢产物；HPLC-MSn

雷公藤甲素(triptolide)是从卫矛科雷公藤属植物雷公藤中分离出来的环氧二萜内酯化合物，是雷公藤的主要活性成分，具有显著的免疫抑制、抗炎、抗肿瘤和抗生育等活性，但同时也是其毒性成分，具有肝脏、肾、心脏和生殖系统等多脏器毒性[1]。文献[2-6]报道甘草与雷公藤配伍能显著降低雷公藤的毒性，但其减毒机制尚不明确。甘草具有肝药酶诱导作用，与其它药物联用后，可能改变药物代谢行为，从而影响药物毒性[7]。目前报道的雷公藤甲素代谢产物较少，主要有单羟基化代谢产物、环氧化物水解开环代谢产物及谷胱甘肽结合物[8-9]。笔者前期采用LC-MS/MS法从雷公藤甲素单独给药和与甘草联合给药的大鼠尿液中发现代谢产物5个(分子量376, 358, 358, 358, 374)[10]。本文首次采用高效液相色谱二极管阵列结合电喷雾离子肼多级质谱进一步研究了雷公藤甲素在大鼠尿液中的代谢产物。结果发现代谢产物4个(分子量376，376，374，390)，其中分子量390代谢物为首次报道。首次分析了代谢产物的电喷雾离子肼多级质谱裂解途径，并初步推断了代谢位点和代谢产物结构。研究结果表明，氧化代谢产物为雷公藤甲素的主要代谢产物，氧化代谢可能为雷公藤甲素的解毒途径。

1材料

1.1仪器与试药Agilent1100LC-MSD-Trap型液质联用仪(四元泵，柱温箱，DAD检测器，美国Agilent公司)；十万分之一分析天平(AE-240，瑞士梅特勒)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；R-201旋转蒸发仪(厦门精艺兴业科技有限公司)；雷公藤甲素对照品(购自南京泽朗医药科技有限公司，含量≥98%，批号分别为ZL111119)；甘草(购自江西药都樟树中药饮片有限公司，产地内蒙，品种为GlycyrrhizauralensisFish.，批号12020101)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国默克公司)；二氯甲烷、丙酮、石油醚、正丁醇、甲醇、乙酸乙酯 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；0.9%的氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司，批号为H10983064)。

1.2动物SD大鼠，体重200～220g(湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(湘)2011-0003)。

2方法

2.1溶液配制甘草溶液的制备：准确称取甘草药材800g，切片，加4倍量水煎煮1 h 2次，过滤，合并滤液，减压蒸干，得甘草浸膏约80g，用适量蒸馏水配制成甘草溶液。

雷公藤甲素注射液的制备：精密称取雷公藤甲素对照品38.7mg，置100mL容量瓶中，用20%丙二醇生理盐水溶液溶解并稀释至刻度。

Kedde's试剂的配制：2%的3,5-二硝基苯甲酸乙醇液与1mol/L的KOH水溶液以1∶1体积比混合，现配现用。

2.2给药与尿液收集健康SD大鼠80只，每天灌胃给予甘草水煎剂(生药量30g/kg)，2 h后腹腔注射给予雷公藤甲素溶液(0.7mg/kg剂量)，放入代谢笼中，自由饮水，连续收集9h尿液。连续给药甘草15 kg及雷公藤甲素350mg，将收集到的尿液合并，减压浓缩后用甲醇溶解保存。

2.4尿液代谢产物的提取和处理将尿液甲醇溶液过滤，去除蛋白，减压蒸干得浸膏。将浸膏用水溶解，依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取。减压回收溶剂得乙酸乙酯部位浸膏3.2 g，正丁醇部位浸膏16.8 g。经TLC检测(Kedde's试剂显色)，结果显示雷公藤二萜内酯类代谢产物主要在乙酸乙酯部位和正丁醇部位。将乙酸乙酯部位的浸膏3.2 g，用甲醇溶解后，经凝胶柱色谱(SephadexLH-20)分离，以甲醇洗脱，每份收集5 mL，得52个流分。经TLC检测，Kedde's试剂显色，合并具有Kedde's试剂显色反应的流份(含雷公藤二萜内酯类代谢产物)，减压蒸干，用10mL甲醇溶解，得代谢产物提取液，作为供试品溶液。

2.5HPLC-DAD-ESI/Trap/MSn测定代谢产物

2.5.1色谱条件Dikma C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱， 0min(10%A)→60min(90%A)；流速1mL/min，DAD-ESI/Trap/MSn检测；柱温为30℃，进样量为10μL。

2.5.2ESI-Trap-MSn测定条件离子源温度325 ℃，毛细管电压3.5 kV，雾化压力14.99psi，干燥氮气流速4.99 L/min，质谱扫描范围m/z 50～800，正离子模式。

图1　雷公藤甲素代谢产物提取物的HPLC图

图2　雷公藤甲素M0

3结果与讨论

雷公藤甲素代谢产物提取物的HPLC图见图1，DAD紫外光谱图见图2。根据HPLC-DAD紫外光谱图，从中发现4个色谱峰(M1-M4，保留时间分别为： 15.348、16.285、29.261和41.662min)的紫外光谱图与药物原型雷公滕甲素相似，而甘草空白尿液中缺失，初步判断这4个色谱峰可能为雷公滕甲素的代谢产物。代谢产物M1-M4的ESI/Trap/MSn图见图3-6。

图3　雷公藤甲素代谢产物M1的ESI/Trap/MSn图

图4　雷公藤甲素代谢产物M2的ESI/Trap/MSn图

图5　雷公藤甲素代谢产物M3的ESI/Trap/MSn图

图6　雷公藤甲素代谢产物M4的ESI/Trap/MSn图

M1的准分子离子有[M+NH4]+m/z 394和[M+H]+m/z 377，[M+H]+m/z 377的可能裂解过程为(见图7)：[M+H]+m/z 377发生取代基断裂连续失去H2O形成离子峰m/z 359、m/z 341。m/z 359再失去3H2O形成离子峰m/z 305。m/z 341继续失去CH2CHCH3、HCHO、CO、CH4等中性分子形成离子峰m/z 299、m/z 269、m/z 223、m/z 325。m/z 325发生7(8)和9(10)位开环形成离子峰m/z 177。m/z 341发生9(11)和13(14)位开环形成离子峰m/z 229、m/z 113。M1的主要碎片离子均得到较合理解析。根据可能代谢途径、分子量以及质谱裂解途径推测M1可能为雷公藤甲素单羟基化产物。据文献报道[11]双键有活化烯丙位代谢作用，烯丙位为代谢活性位点，因此推测M1可能为2(或5)-羟基雷公藤甲素。

图7　雷公藤甲素代谢产物M1的质谱可能裂解途径

图8　雷公藤甲素代谢产物M2的质谱可能裂解途径

M2的准分子离子[M+H]+ m/z377的可能裂解过程与M1相似，主要发生失去H2O、CH3CH2CH3、HCHO、CO等中性分子以及开环(见图8)。M2的分子量与M1同样为376，可能为雷公藤甲素的另一单羟基化产物。根据可能代谢途径、分子量以及质谱裂解途径推测M2为2(或5)-羟基雷公藤甲素。

M3的准分子离子[M+H]+m/z 375的可能裂解过程与M1和M2相似(见图9)。M3的分子量为374，比M1和M2少2个质量数。烯丙位羟基较容易进一步代谢氧化为羰基，因此M3可能为M1或M2的羟基进一步被氧化成羰基产物。根据可能代谢途径、分子量以及质谱裂解途径，结合烯丙位为代谢活性位点，推测M3为2-羰基雷公藤甲素。

图9　雷公藤甲素代谢产物M3的质谱可能裂解途径

M4的准分子离子[M+H]+m/z 390的可能裂解过程与其他代谢物相似(见图10)。M4的分子量为390，比M3多16个质量数，可能为M3的另一烯丙位进一步被羟基化形成。根据可能代谢途径、分子量以及质谱裂解途径，结合烯丙位为代谢活性位点，推测M4为2-羰基-5-羟基雷公藤甲素。分子量为390的雷公藤甲素代谢物为首次报道。

图10　雷公藤甲素代谢产物M4的质谱可能裂解途径

4结论

本文首次采用高效液相色谱二极管阵列结合电喷雾离子肼多级质谱法研究了配伍甘草后雷公藤甲素在大鼠尿液中的代谢产物。发现代谢产物4个，其中单羟基化代谢物2个，羰基化代谢物1个，羟基及羰基化代谢物1个。分子量分别为376，376，374和390，其中分子量390代谢物为首次报道。根据DAD紫外光谱图、电喷雾离子肼多级质谱以及药物体内代谢特点初步鉴定为：2(或5)-羟基雷公藤甲素，2-羰基雷公藤甲素，2-羰基-5-羟基雷公藤甲素。并首次分析了代谢物的电喷雾离子肼质谱裂解途径。研究结果表明：氧化代谢产物为雷公藤甲素的主要代谢产物，氧化代谢可能为雷公藤甲素的解毒途径。

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征稿启事

《江西中医药》所设的重点栏目有《明医心鉴》、《滕王阁医话》等。《明医心鉴》以介绍名老中医经验和中医临证心得为主，重点刊载中医关于疑难病的诊疗经验，要求观点、方法新，经验独到。《滕王阁医话》主要反映中医教学、科研、临床的一得之见，要求以小见大，有感而文，语言生动流畅，可读性强，富于知识性、趣味性。

Identification of Metabolites from Triptolide in Vivo

LIU Jian-qun, WANG Xue-mei, ZHANG Guo-hua, SHU Ji-cheng, ZHANG Rui

KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China.

Abstract:Objective: To identify the metabolites of triptolide combined with Glycyrrhiza uralensis in vivo and disclose the attenuation mechanism of Glycyrrhiza uralensis on Tripterygium wilfordii. Methods: The SD rats were injected with triptolide after orally taken with extracts of Glycyrrhiza uralensis. The metabolites of triptolide in rat urine were identified by HPLC-DAD-ESI/Trap/MSnmethod. Results: Four metabolites (molecular weight of 376, 376, 374, 390 ) of triptolide in rat urine were found and initially identified as 2(5)-OH- triptolide(M1，M2), 2-oxo-triptolide(M3), 2-oxo-5-OH-triptolide(M4), respectively. Conclusion: The metabolite (M4) is reported for the first time. The main metabolites of triptolide are oxidates.

Key words:Triptolide; Glycyrrhiza uralensis; Metabolic Products; HPLC-MSn

收稿日期：(2014-06-23)编辑：曾文雪

中图分类号：R96

文献标识码：A

基金项目：*国家自然科学 (81160541)；江西省卫生厅中医药科研计划项目(2011A143)。