★　王志福第一作者：王志福(980—)，男，博士，讲师。研究方向：疼痛的中西医结合基础与临床。E-mail:wzf9900@6.com。　俞向梅　龚德贵　林心君　王彦青　吴根诚　(.福建中医药大学中西医结合学院　福州 50；.福建中医药大学附属康复医院　福州 50；.复旦大学上海医学院中西医结合系　上海 000)

身痛逐瘀汤对大鼠神经病理性疼痛及脊髓p38 MAPK蛋白表达的影响*

★王志福1*第一作者：王志福(1980—)，男，博士，讲师。研究方向：疼痛的中西医结合基础与临床。E-mail:wzf993002@163.com。俞向梅1龚德贵2林心君1王彦青3吴根诚3(1.福建中医药大学中西医结合学院福州 350122；2.福建中医药大学附属康复医院福州 350122；3.复旦大学上海医学院中西医结合系上海 230002)

摘要：目的：观察中药复方身痛逐瘀汤对CCI大鼠神经病理性疼痛及脊髓p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)蛋白的影响。方法：SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、身痛逐瘀汤单倍剂量组(6.5g/kg) 、身痛逐瘀汤双倍剂量组(13 g/kg)。假手术组切开暴露坐骨神经而不结扎，模型组结扎坐骨神经诱导神经痛模型，术后未给予干预治疗。给药组在造模后第3天开始灌胃给药，在造模后第3，5，7，14d观察大鼠热痛阈、机械痛阈、运动评分值的变化，免疫荧光检测CCI大鼠小胶质细胞活化情况，Western-Blot检测大鼠脊髓p38蛋白表达变化。结果：在造模后第7d和第14d，与假手术组相比，模型组大鼠热痛阈值、机械痛阈值出现显著降低，右侧后肢运动功能评分显著升高(P<0.01)，小胶质细胞标记物OX-42免疫阳性物质表达显著增多；与模型组相比，身痛逐瘀汤给药组均可显著提高热痛、机械痛阈值(P<0.05；P<0.01)，并降低右侧后肢运动评分值(P<0.01)。与假手术组相比，模型组大鼠在造模后第7d和第14d脊髓磷酸化p38蛋白(p-p38)表达显著上调(P<0.01)；与模型组相比，身痛逐瘀汤给药组在造模后第14d可显著下调脊髓p-p38蛋白的表达(P<0.01)。结论：中药复方身痛逐瘀汤可抑制CCI大鼠的痛敏反应，改善患侧后肢运动功能，其机制可能与下调脊髓磷酸化p38蛋白表达，降低脊髓神经炎症反应有关。

关键词：身痛逐瘀汤；神经痛；p38MAPK

神经病理性疼痛(Neuropathic Pain，简称神经痛)是由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛。本课题组前期研究表明，在神经痛的发生发展过程中，脊髓中枢出现敏化现象，可表现为胶质细胞活化及炎性细胞因子释放。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路是细胞内应激反应信号通路，与炎症和疼痛发生密切相关[1-4]。有研究表明，脊髓磷酸化p38蛋白主要存在于小胶质细胞中，并在神经痛发生中发挥重要作用，应用磷酸化p38蛋白抑制剂可显著减轻神经痛的痛敏反应[5]。身痛逐瘀汤作为经典方剂之一，基于中医理论“不通则痛”治疗痹证，临床治疗效果明确。本文以身痛逐瘀汤为研究药物，通过坐骨神经慢性压迫性损伤(Chronic Constriction injury ，CCI)制备经典神经痛模型，观察身痛逐瘀汤对神经痛大鼠痛行为学、运动功能及脊髓p38蛋白变化的影响，为今后临床应用治疗提供理论依据。

1实验材料

1.1动物清洁级雄性SD大鼠，体重200～220g，购于上海西普尔-必凯实验动物中心。许可证号SCXK(沪)2008-0016。

1.2受试药物身痛逐瘀汤处方药材购于福建中医药大学附属国医堂医院门诊部，经鉴定符合2010年版《中国药典》相应标准。药方组成及剂量依据《方剂学》(邓中甲主编，2010年第二版，中国中医药出版社)制备，详细如下：桃仁9g，红花9g，当归9g，川芎9g，没药6g，五灵脂6g，秦艽3g，羌活3g，地龙6g，香附3g，牛膝6g，甘草6g。中药浸泡2h，先加入12倍量水，煎煮40min后过滤药渣，再加8倍量水煎煮40min后过滤，两次滤液合并，浓缩后4℃保存。根据实验大鼠和人的体表面积比例系数换算，确定大鼠原方单倍给药剂量为6.5g/kg，双倍给药剂量为13g/kg，每日灌胃给药1次。模型组以等剂量溶液的蒸馏水灌胃。

1.3试剂和仪器p38、GAPDH抗体购于美国Abcam公司；OX-42免疫荧光试剂盒(上海碧云天试剂公司)；336型辐射热测痛仪(美国);Reichert-Jung恒冷切片机(德国);垂直电泳槽(上海天能科技有限公司);SYNGENE生物图像系统(美国);biotek酶标仪(美国);UITRA TURRAX匀浆仪(美国);Heraeus离心机(上海纳锘实业有限公司);倒置显微镜(日本)。

2实验方法

2.1CCI模型建立健康雄性清洁级SD大鼠60只，体重(200±20)g，饲养于12h光照、12h黑暗的环境中，自由摄食和饮水。对动物的处理严格遵守有关国际实验动物使用准则，应用随机数字表将SD大鼠分为假手术组(Sham)、模型组(CCI)、身痛逐瘀汤单倍剂量组(6.5g/kg)、身痛逐瘀汤双倍剂量组(13g/kg)，每组各15只。每组实验动物中，10只用于痛行为学及运动功能评价，5只用于分子指标检测。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(按4mL/kg注射)后，右侧后肢皮肤切开，肌肉钝性分离，暴露坐骨神经，在坐骨神经中段用4-0铬制羊肠线松扎四道，建立CCI神经痛大鼠模型，术后青霉素粉末预防感染。该实验模型建立条件成熟，可重复性好，已被国内外实验研究广泛应用[1-2]。假手术组只暴露坐骨神经不结扎，其他手术操作如模型组。给药组在造模后第3天开始灌胃给药，每日1次，持续至第14天，痛行为学及运动功能评分测定在造模后第3，5，7，14d进行，实验取材在造模后第7d及第14d进行。

2.2痛行为测定根据前期的研究方法[1-4]，机械痛采用Von-Frey法进行检测，即利用不同强度的纤毛刺激大鼠足掌中心部位，引起大鼠缩爪反应。最小能引起缩爪反应的纤毛压力即为大鼠的缩爪反应阈值，以此反应大鼠的机械痛敏情况，纤毛刺激克数包括1.4，2，4，6，8，10，15 g。热痛采用辐射热测痛仪测定，大鼠放入玻璃格子中自由活动，静置20 min后，辐射热强光照射大鼠足掌，测定大鼠的缩爪潜伏期(Paw Withdrawal Latency，PWL)。测定时，每只大鼠左右足掌交替测定，每次间隔不低于1 min，大鼠PWL基本稳定后取后3次测定结果的平均值作为基础值(Baseline)。测定时热源强度维持在恒定水平，使基础痛阈控制在8～12s左右。为防止大鼠热辐射烫伤，将PWL的上限值(cut-off time)定为20s。

2.3运动功能评分参照Hwang方法[6]，分别观察实验前及第3，5，7，14d中药治疗后大鼠右侧后肢的运动情况。将运动功能共分为4级：0分没有运动改变，正常行走；1分轻度运动功能减弱，对足底的刺激缩爪反应正常：2分自主活动减弱，中度运动功能减弱，正常行走，对足底的刺激有缩爪反应，但减弱；3分不能自主活动。

2.4分子指标检测各组大鼠在实验结束后，用腹腔注射10%水合氯醛(4mL/kg)麻醉后，一部分大鼠迅速取出脊髓节段L4-5背角置于液氮中，最后储存于-70℃保存待测；另一部分大鼠灌流固定后取脊髓L4-5节段，并进行冰冻切片后保存。Western Blot检测脊髓L4-5节段背角p38蛋白表达变化，免疫荧光检测脊髓OX-42免疫阳性物质表达变化，检测方法严格按照试剂盒说明书规范操作。

3结果

3.1身痛逐瘀汤对CCI大鼠热痛、机械痛阈值的影响CCI大鼠造模术后第3，5，7，14d，与假手术组相比，右侧后肢足底热痛、机械痛阈值均显著降低。单倍与双倍剂量中药复方身痛逐瘀汤灌服从术后第3天开始，灌胃至术后第7，14d后，与模型组相比，右侧后肢足底热痛、机械痛阈值均显著提高；单倍与双倍剂量组相比，二者未见显著性差异，见图1-2。

图1　各组机械痛阈值变化

注：与假手术组相比，1)P<0.01；与模型组相比，2)P<0.05，3)P<0.01。

图2　各组热痛阈值变化

注：与假手术组相比，1)P<0.01；与模型组相比，2)P<0.05，3)P<0.01。

图3　各组大鼠右后肢运动功能分值变化

注：与假手术组相比，1)P<0.01；与模型组相比，2)P<0.01。

3.2身痛逐瘀汤对CCI大鼠患侧后肢运动功能的影响CCI大鼠造模术后第7，14d，与假手术组相比，右侧后肢运动功能评分值显著升高，后肢运动功能明显减弱。单倍与双倍剂量中药复方身痛逐瘀汤灌服从术后第3d开始，灌胃至术后第14d后，与模型组相比，右侧后肢运动功能评分值均显著下降；单倍与双倍剂量组相比，二者未见显著性差异，见图3。

3.3身痛逐瘀汤对CCI大鼠脊髓OX-42免疫阳性物质表达的影响 CCI大鼠造模术后第7，14d，与假手术组(Sham)相比，脊髓背角OX-42免疫阳性物质表达大量增加。单倍与双倍剂量中药复方身痛逐瘀汤灌服从术后第3d开始，灌胃至术后第14d后，与模型组(术后第7，14d)相比，二者均可明显降低脊髓背角OX-42免疫阳性物质的表达数量。

3.4身痛逐瘀汤对CCI大鼠脊髓p38蛋白表达的影响CCI大鼠造模术后第7，14d，与假手术组(Sham)相比，脊髓背角磷酸化p38蛋白表达显著增加。单倍与双倍剂量中药复方身痛逐瘀汤灌服从术后第3d开始，灌胃至术后第14d，与模型组(术后第14d)相比，二者均可明显降低脊髓背角磷酸化p38蛋白表达。单倍与双倍剂量组相比，二者未见显著性差异，见图4。

图4　各组大鼠脊髓p38蛋白表达情况

注：与假手术组相比，1)P<0.01，2)P<0.01；与模型组相比，3)P<0.01，4)P<0.01。

4讨论

身痛逐瘀汤出自《医林改错》卷下，具有活血祛瘀，祛风除湿，通痹止痛之功效，在实验性癌痛、炎性痛中发挥显著的抗炎镇痛作用[7-8]。CCI诱导神经痛大鼠模型，在一定程度上模拟临床干性坐骨神经痛情况。坐骨神经痛属中医“痹证”范畴，根据王清任“痹证有瘀血说”，基于“活血通痹”方法治疗各种痹证，临床镇痛效果显著[9-11]。本实验应用经典方剂身痛逐瘀汤观察其对CCI大鼠的镇痛作用，研究结果表明，CCI诱发神经痛时，大鼠足底出现显著的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏，右侧后肢运动功能显著减弱。神经痛发生发展过程中，脊髓背角小胶质细胞活化明显，表现为脊髓OX-42免疫阳性物质表达增加，脊髓磷酸化p38蛋白表达显著上调。应用不同剂量身痛逐瘀汤灌胃治疗，二者均可明显提高热痛阈值和机械痛阈值，减轻痛敏反应，并显著改善神经损伤诱发的运动功能。此外，身痛逐瘀汤可显著抑制表达上调的脊髓OX-42免疫阳性物质及磷酸化p38蛋白。而关于身痛逐瘀汤如何抑制p38蛋白磷酸化，减轻中枢敏化现象，是否可通过调节周围神经-免疫功能，发挥中枢及外周抗炎镇痛效应，有待于今后深入研究探讨。

参考文献

[1]王志福.脊髓脂氧素在大鼠神经痛及电针镇痛中的作用及其机制研究[D].上海：复旦大学，2013.

[2]Wang ZF, Li Q, Liu SB,et al.Aspirin-triggered Lipoxin A4 attenuates mechanical allodynia in association with inhibiting spinal JAK2/STAT3 signaling in neuropathic pain in rats[J].Neuroscience,2014,273:65-78.

[3]Li Q, Tian Y, Wang ZF, et al.Involvement of the spinal NALP1 inflammasome in neuropathic pain and aspirin-triggered-15-epi-lipoxin A4 induced analgesia[J].Neuroscience.2013; 254:230-40.

[4]Li Q, Yue N, Liu SB,et al.Effects of chronic electroacupuncture on depression- and anxiety-like behaviors in rats with chronic neuropathic pain[J].Evid Based Complement Alternat Med, 2014:158987.

[5]Ji RR, Suter MR. p38 MAPK, microglial signaling, and neuropathic pain[J].Mol Pain,2007，1，3:33.

[6]Jai Hyun Hwang，Tony L，Yaksh．The effect of spinal GABA receptor agonists on tactile allodynia in a surgically-induced neuropathic pain modelin the rat[J].Pain，1997，70：15-22.

[7]任炳旭，马正良，靳艳卿,等.身痛逐瘀汤对骨癌痛小鼠痛行为及脊髓星形胶质细胞活化的影响[J].中国中西医结合杂志,2011,31(3):381-385.

[8]王锦波，安莉萍.身痛逐瘀汤对佐剂关节炎大鼠纤维蛋白原水平的影响[J].新疆中医药,2008,26(2):9-11.

[9]阮洪生，刘树民.身痛逐瘀汤治疗骨伤科疾病临床研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(9):275-277.

[10]赵剑锋，王希贵，任国奎,等.身痛逐瘀汤加味治疗坐骨神经痛82例[J].中医药信息,2000,17(4):58.

[11]郑锦英.加减身痛逐瘀汤治疗痹证的临床体会[J].中国实验方剂学杂志,2007,13(10):8,21.

Effects of Shentong Zhuyu Decoction on Neuropathic Pain and the p38 MAPK Protein Expression in Spinal Cord in Rats

WANG Zhi-fu1, YU Xiang-mei1, GONG De-gui2, LIN Xin-jun1, WANG Yan-qing3, WU Gen-cheng3

1.IntegrativeMedicineCollege,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine(TCM)，Fuzhou350122，China;

2.FujianUniversityofTCMSubsidiaryRehabilitationHospital，Fuzhou350122，China;

3.DepartmentofIntegrativeMedicineandNeurobiology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai, 230002，China.

Abstract:Objective: To investigate the analgesic effect of Shentong zhuyu decoction in neuropathic pain and the effect on the expression of p38 Mitogen-activated protein kinase in CCI rats. Method: SD rats were randomLy divided into Sham operation group(Sham)，Chronic constrictive injury group(CCI), Shentong zhuyu group(6.5 g/kg) and Shentong zhuyu group(13 g/kg). Paw withdrawal latency(PWL) , mechanical withdrawal threshold(MWT), Sports score values, activation of microglial cell, spinal phosphorylation protein of p38 was tested respectively 3，5，7，14 day afer CCI surgery.Result: The result showed that Shentong zhuyu decoction had significantly enhanced the values of PWLand MWT, and inhibited the upregulation of spinal p38 phosphorylation protein.Conclusion: Shentong zhuyu decoction could inhibit the pain hyperalgesia, improve the motor function of right hind limb. The mechanism of analgesic effect might be associated with the downgulation of p38 protein.

Key words:Shentong Zhuyu decoction；neuropathic pain；p38MAPK

收稿日期：(2014-10-30)编辑：曾文雪

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

基金项目：*国家自然科学 (81072875)。