徐向辉 盛金鑫 张坤东 黄陈

信号转导与转录激活因子3(signal transduction and activators of transcription, STAT3)是细胞内一关键的信号转导与转录激活蛋白，当其上游Janus激酶被细胞因子或生长因子激活后，进而激活STAT3，形成磷酸化STAT3(p-STAT3)，2个p-STAT3分子相互作用形成二聚体进入细胞核，通过调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管新生等参与肿瘤的进展，目前已经被定义为癌基因[1-2]。研究证实，STAT3和p-STAT3在胰腺癌组织中过表达，且p-STAT3与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及微血管密度(microvessel density，MVD)相关[3-4]，提示STAT3的激活在胰腺癌血管生成中起重要作用。本研究采用RNA干扰技术抑制SW1990细胞STAT3基因的表达，观察基因沉默后对细胞增殖及裸鼠移植性胰腺癌生长的影响，探讨其相关机制。

材料与方法

一、STAT3 shRNA表达载体的构建及细胞转染

参考Genscript公司设计siRNA的在线软件，选取针对STAT3编码区1819～1837、1025～1043、237～255三段碱基序列作为RNA干扰靶序列，将其插入pRNAT-U6.1/Neo质粒中，构建重组质粒pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅰ、pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ和pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅲ，并同时设计阴性对照序列，构建阴性对照重组质粒pRNAT-Con。前期研究证明pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ对STAT3具有最好的沉默效果[5]，因此本研究选取pRNAT-STAT3 shRNA-Ⅱ稳定转染细胞。人胰腺癌细胞株SW1990购自ATCC(American Type Culture Collection)，常规培养、传代。取对数生长期SW1990细胞，以每孔2×105个接种于6孔培养板中，按照Invitrogen公司说明书配制质粒-脂质体复合物，并转染细胞。应用G418(500 μg/ml)筛选稳转细胞株。实验分为SW1990组、SW1990-Con组和SW1990-RNAi组。

二、蛋白质印迹法

取各组对数生长期细胞，采用Santa Cruz公司的细胞总蛋白抽提试剂盒和Active Motif公司的细胞核蛋白抽提试剂盒分别提取各组细胞的总蛋白和核蛋白。采用常规蛋白质印迹法检测细胞的STAT3、VEGF、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)蛋白的表达，以β-actin为内参。……