蒋庆琳等

摘 要 为探究直接检测瓜类单粒种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的快速检测技术，以一步法RT-PCR为基础，构建同时扩增CGMMV基因组3′端和5′端基因的（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR和巢式双重IC-RT-PCR技术，灵敏度分别为10-3、10-3、10-4，巢式双重IC-RT-PCR灵敏度比双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR高10倍。对不同种质、不同来源的种子及种子的不同部位进行检出率比较，巢式双重IC-RT-PCR检出率高于其它2个检测技术，试验种子种表带毒检出率高于种子组织研磨物，商用种子种表带毒检出率低于种子组织研磨物。为有效阻断毒源，建议同时对种表和种子组织研磨物进行检测，种表采用双重RT-PCR检测，种子组织研磨物采用双重IC-RT-PCR或巢式双重IC-RT-PCR检测。

关键词 黄瓜绿斑驳花叶病毒；双重RT-PCR；双重IC-RT-PCR；巢式双重IC-RT-PCR；种子检测

中图分类号 S41-31 文献标识码 A

Abstract A comparative study on three one-step RT-PCR-based methods for rapid detection of CGMMV from individual cucurbitaceous seed is presented. Specific primers based on the 3′- and 5′-terminal regions of the CGMMV genome were screened and used for duplex RT-PCR， IC-RT-PCR， and nested-IC-RT-PCR detection. The results showed that the sensitivities of the three methods were 10-3， 10-3 and 10-4 respectively， with the latter method being the most sensitive. The nested-IC-RT-PCR method had higher detection rates than the other two methods in the detection of the seeds from different germplasms， sources or parts as well. In addition， the results showed that CGMMV detection rates obtained from the surface of experimental seeds were higher than those from ground seed tissue， and that from the surface of commercial seeds were lower than the latter. For effective quarantine， we suggest both the seed surface and ground seed tissue be subjected to RT-PCR detection， the former by duplex RT-PCR and the latter by duplex IC-RT-PCR or nested-IC-RT-PCR.

Key words CGMMV； Duplex RT-PCR； Duplex IC-RT-PCR； Duplex nested-IC-RT-PCR； Seed detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.033

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）属烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员，是为害葫芦科作物的主要病毒之一。自1935年Ainsworth[1]首次发现并报道后，CGMMV通过种子带毒进行远距离传播，已广泛分布在欧洲、印度、日本等国家和地区[2-4]。2005年中国首次报道CGMMV侵染广西观赏南瓜[5]，2006年辽宁省盖州市西瓜大面积感染CGMMV，损失严重[6]。CGMMV对中国西瓜等葫芦科作物生产已造成严重威胁和损失，农业部发布第788号公告，将CGMMV确定为全国农业植物检疫性有害生物[7]。快速、灵敏、简便的种子带毒检测方法是控制CGMMV传播和扩展的有效途径。目前，CGMMV种子带毒检测方法主要有生物学技术[8]、血清学技术[5，9-11]和分子生物学技术[10，12-14]。由于生物学技术工作量大、周期长，带毒种子长成的植株不一定感病，血清学技术灵敏度低，易造成漏检。因此具有灵敏度高、特异性强、操作简便的分子生物学技术已成为主要检测技术。鉴于种子中含有的多糖及次生代谢物质影响RNA提取质量[10]，造成RNA降解，检测CGMMV单一目的片段的常规RT-PCR容易造成漏检，根据CGMMV的全基因组序列，在5′端和3′端分别设计特异引物对，在一步法RT-PCR的基础上，在同一个反应中同时检测CGMMV 5′端和3′端的2个基因片段，构建（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR检测技术，并研究适宜不同种质、不同来源的种子及种子不同部位的检测技术，提高检测的可靠性，对防止该病毒通过种子传播扩散，保护中国葫芦科作物健康生产有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 种子 感病种子：试验种子，四叶期接种的感病黄瓜（粤秀3号）、苦瓜（丰绿）、丝瓜（夏宝）植株结果成熟后，收获成熟饱满的种子，清洗一遍后，吸干水份晾干，室温保存。商用种子，黄瓜种子和南瓜种子为广东省检疫部门惠赠，黄瓜品种为新农3号，南瓜品种为旺优蜜本，距生产日期1 a。

1.1.2 供试毒源 2006年底采自广东省海丰县的西瓜（Citrullus lanatus）病叶保存在-80 ℃超低温冰箱，西瓜病叶常规汁液摩擦接种黄瓜幼苗，栽培于防虫网室内，以发病的黄瓜（Cucumis sativus）植株作为后续试验的毒源。

1.1.3 主要试剂 TaKaRa PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2购于大连宝生物工程有限公司；RNAiso Plus购于大连宝生物工程有限公司；CGMMV抗体购自美国Agdia公司CGMMV ELISA检测试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 引物合成、设计 根据GenBank已报道的CGMMV基因组序列，应用DNAman 4.0软件（Lynnon BioSoft，Quebec，Canada）分析各分离物基因组保守序列，在3′端外壳蛋白基因（coat protein gene，CP）和运动蛋白基因（move protein gene，MP）处设计4条上下游引物，在5′端设计4条上下游引物（见表1），其中3′端上游引物F1、F2，3′端下游引物R1、R2与李小妮等[15]报道相同。（一步法）双重RT-PCR和双重IC-RT-PCR引物对组合为F2/R1与5L1/5R1；巢式双重IC-RT-PCR外引物对组合和内引物对组合分别为：F1/R2、5L1/5R1和F2/R1、5L2/5R2。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

1.2.2 特异性检测 参照RNAiso Plus说明书提取黄瓜、西瓜、苦瓜、丝瓜、冬瓜、葫芦、小西葫芦叶片总RNA，通过RT-PCR检测（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR引物对组合和巢式双重IC-RT-PCR外引物对组合的特异性。RT-PCR反应体系为15 μL：RNase-free water 2.2 μL，2×1 step buffer 7.5 μL，每条引物1 μL，共4 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 0.3 μL，RNA 1 μL。扩增程序为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；补充延伸72 ℃ 5 min。

1.2.3 （一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR检测技术的比较

（1）灵敏度比较。以感病的黄瓜叶片为材料，将0.1 g感病叶片与PBST研磨缓冲液以1/10（w/V）充分研磨后，用PBST 10倍系列稀释，10 000×g离心10 min，上清液即为检测用的病叶粗汁液，取400 μL病汁液参照RNAiso Plus抽提RNA进行双重RT-PCR，剩余的病汁液用于双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR，比较各检测技术的灵敏度。双重RT-PCR反应体系和扩增程序同1.2.2。双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR方法为：第一，病毒捕获：PCR管中加入50 μL以1 ∶ 500稀释的CGMMV抗体37 ℃孵育2 h或4 ℃过夜，用PBST洗涤液（不含NaDIECA）洗3次，每次洗涤停留2 min，吸取50 μL待检样品于200 μL PCR管中，37 ℃恒温箱孵育3 h，PBST洗3次，DEPC水洗1次，洗毕短暂离心吸去余液，室温晾干；第二，病毒裂解和RT-PCR：向PCR管中加入RNase-free water 3.0 μL，2×1 step buffer 7.5 μL，每条引物1 μL，共4 μL然后将反应管置于PCR仪中，95 ℃加热5 min，立即转移至冰上，冰浴2 min，向管中加入TaKaRa PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.5 μL，放入PCR仪进行扩增，扩增程序同1.2.2；第三，巢式双重IC-RT-PCR第二轮反应：共25 μL体系，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，rTaq 0.2 μL，DEPC水16.8 μL，每条引物1 μL，共4 μL，以第二的产物稀释20～50倍为模板，1 μL。扩增程序：94 ℃ 2 min后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，补充延伸72 ℃ 5 min。

（2）各检测技术对不同作物种子带毒检出率比较。第一，种表带毒率检测：以单粒试验种子为单位，检测30粒黄瓜种子、苦瓜种子、丝瓜种子（单粒种子重约：黄瓜0.03 g，苦瓜0.2 g，丝瓜0.1 g，储存5～6个月）。单粒种子用500 μL PBST浸泡30 min后，取出种子，获得种表浸泡液，先取400 μL抽提RNA用于双重RT-PCR，再分别取50 μL用于双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR比较各检测技术的检出率。

第二，种子组织研磨物带毒率检测：取出浸泡后的种子，液氮研磨后加入500 μL PBST研磨缓冲液或直接加500 μL PBST研磨液充分研磨，10 000×g离心10 min，取上清各100 μL用于IC-RT-PCR、巢式IC-RT-PCR，剩余上清和种子组织加入RNAiso Plus RNA提取液充分研磨（黄瓜、苦瓜、丝瓜种子分别加入1、5、2 mL），室温静止5 min；加入氯仿/异戊醇（24 ∶ 1）（分别加入500、2 500、500 μL），剧烈振荡15 s，冰浴10 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；后续步骤同RNAiso Plus说明（异丙醇用量改用500、1 500、500 μL）比较各检测技术的检出率。

（3）（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR检测进出口岸商用种子应用。以商用种子为检测对象，检测24粒黄瓜种子和30粒南瓜种子的种表和种子组织研磨物带毒情况，比较各检测技术，方法同（2）。

2 结果与分析

2.1 （一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR引物对组合特异性检测

以感染CGMMV的黄瓜、西瓜、苦瓜、丝瓜、冬瓜、葫芦、小西葫芦作物叶片组织总RNA为检测对象，对双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR引物对组合和巢式双重IC-RT-PCR外引物对组合进行RT-PCR特异性检测，结果表明能成功检测感染CGMMV的黄瓜、西瓜、苦瓜、丝瓜、冬瓜、葫芦、小西葫芦作物叶片组织，双重RT-PCR和双重IC-RT-PCR引物对组合F2/R1与5L1/5R1，扩增目的片段大小分别为309、748 bp，巢式双重IC-RT-PCR外引物对组合F1/R2、5L1/5R1，扩增目的片段大小分别为1 475、748 bp，相应健康作物叶片组织对照无条带，表明引物对特异性高（见图1）。

2.2 一步法双重RT-PCR、IC-RT-PCR、巢式IC-RT-PCR灵敏度比较

以感病的黄瓜叶片为材料，用PBST 10倍梯度稀释，进行（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR检测技术灵敏度比较。结果发现，2条目的条带均清晰扩增的稀释倍数分别为103倍、103倍、104倍，巢式双重IC-RT-PCR灵敏度比双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR高10倍（见图2）。

2.3 不同作物种子（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR检出率比较

（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR分别检测30粒黄瓜、苦瓜、丝瓜试验种子的种表和种子组织研磨物带毒情况，结果发现，不同检测方法检测不同种子及部位，检出率各异（见表2）。巢式双重IC-RT-PCR带毒检出率总体高于双重RT-PCR和双重IC-RT-PCR，种表带毒检出率高于种子组织研磨物检出率。黄瓜种子种表带毒检出率用双重RT-PCR和巢式双重IC-RT-PCR检测高于双重IC-RT-PCR；黄瓜种子组织研磨物和丝瓜种子种表带毒检出率用双重RT-PCR检测高于另外2个技术；苦瓜种子的种表、种子组织研磨物和丝瓜种子组织研磨物的带毒检出率用巢式双重IC-RT-PCR检测高于另外2个技术。

2.4 （一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR检测技术的应用

（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR对24粒黄瓜种子和30粒南瓜种子的种表和种子组织研磨物进行检测，结果发现，巢式双重IC-RT-PCR带毒检出率高于双重IC-RT-PCR和双重RT-PCR，种子组织研磨物带毒检出率高于种表带毒检出率。放置1 a的商用黄瓜种子和南瓜种子用双重RT-PCR检测种表和种子组织研磨物结果均为0；双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR检测黄瓜种子种表结果均为8.3%，检测黄瓜种子组织研磨物结果分别为8.3%、33.3%，检测南瓜种子种表结果分别为0、16.7%，检测南瓜种子组织研磨物结果分别为0、36.7%（见表3）。

3 讨论与结论

（一步法）双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR、巢式双重IC-RT-PCR应用于试验种子和商用种子携带CGMMV的带毒率检测，结果表明巢式双重IC-RT-PCR以其高灵敏度性，检出率总体高于双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR，不同种质、不同来源的种子及种子的不同部位的检出率存在差异，即试验种子检出率高于商用种子，试验种子的种表带毒检出率总体高于种子组织研磨物，商用种子的种表带毒检出率低于种子组织研磨物。除受CGMMV主要附着在种子表皮[16]，且不同瓜类CGMMV种子带毒率不同[6]等因素影响外，储藏时间的不同，对种子处理方式不同也会影响检出率，即试验种子采集后清洗一遍吸干水份后晾干，而商用种子通常会对种子进行清洗或消毒等多次处理造成种表携带病毒含量不同。另外，采种时，携带病毒的果肉汁液残留种表的多少以及不同种子表皮结构对病毒依附种表的影响，也会影响不同种子及种子不同部位的检出率。而用双重IC-RT-PCR和巢式双重IC-RT-PCR检测试验种子的丝瓜种子，种子组织研磨物带毒检出率高于种表；试验种子的黄瓜种子组织研磨物和丝瓜种子种表用巢式双重IC-RT-PCR检测，带毒检出率低于双重RT-PCR，而商用种子不存在此类现象，除受检测技术灵敏度的影响外，不同种子RNA提取质量受多糖及次生代谢物质限制的差异，种子带毒量的多少，以及免疫RT-PCR抗体的特异性、抗体与PCR管结合力和病毒的捕获能力等因素也会造成检出率差异。

综合考虑3种检测技术，巢式双重IC-RT-PCR以其高于双重RT-PCR和双重IC-RT-PCR 10倍的灵敏度，适用于带毒率较低、多糖及次生代谢物质含量较高以及储存时间较长的种子带毒检测；双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR以其快速、简便，适用于带毒率较高、多糖和次生代谢物质较少以及储存时间较短的种子带毒检测。为有效阻断毒源，建议种表采用双重RT-PCR检测，种子组织研磨物采用双重IC-RT-PCR或巢式双重IC-RT-PCR检测，并对种表和种子组织研磨物同时进行检测。为提高效率，可增加检测样本量，对多粒种子种表同时进行处理，种子种表总RNA提取可直接用RNAiso Plus浸泡提取。另外，RT-PCR检测种子组织研磨物时，若在加入氯仿/异戊醇（24 ∶ 1）冰浴10 min后，上层液体浑浊不清含大量种子研磨物时，重新将上层液体转移至新离心管中，加入适量RNAiso Plus RNA提取液和氯仿/异戊醇（24 ∶ 1）直至冰浴10 min后，上层液体较为清澈时进行后续步骤可成功提取RNA。

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