丁广洲，李永刚，赵春雷，王希，张玉霜，刘娜，陈丽，陈连江*

（1.黑龙江省甜菜工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150080；2.东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨150030；3.中国农业科学院甜菜研究所，黑龙江哈尔滨150080）

我国甜菜花叶病毒基因与马铃薯Y病毒属其它家族序列的比较与分析

丁广洲1，3，李永刚2，赵春雷1，3，王希1，3，张玉霜1，3，刘娜1，3，陈丽1，3，陈连江1，3*

（1.黑龙江省甜菜工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150080；2.东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨150030；3.中国农业科学院甜菜研究所，黑龙江哈尔滨150080）

为弄清发生在我国甜菜花叶病毒的基因序列基本特征，将发生和流行于我国的甜菜花叶病毒基因与美国和斯洛伐克等地的花叶病病毒以及同属于马铃薯Y病毒属的其它病毒进行比较和分析。研究表明，我国甜菜花叶病毒基因全序列9591bp，编码3085个氨基酸，含有若干马铃薯Y病毒属高度保守的结构功能域。该病毒含有10个结构蛋白（分别为P1，HC-pro，P3，6K1，CI，6K2，VPg，NIa，NIb和CP），并将各蛋白的交割位点序列与其它马铃薯Y病毒属成员进行了比较。通过构建系统发育树，甜菜花叶病毒与落葵皱纹花叶病毒、平莲花叶病毒较高度同源，另与花生斑驳病毒和香雪兰花叶病毒近缘。

甜菜花叶病毒基因；马铃薯Y病毒属；系统发育

甜菜花叶病毒是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）Y病毒属（Potyvirus）家族的典型成员，病毒粒子为线性，单分子正义RNA。甜菜花叶病毒在体外相对不稳定，10 min热灭活点55～60℃，一般稀释限点为1/4000。20℃的传染潜伏时间最高可达48 h。-20℃传染性存活期限为1年左右。甜菜花叶病是较具破坏性的流行病害之一，由于该病毒可经多种蚜虫非持久性传播，而且寄主范围十分广泛，所以，在田间防治上相对比较困难。在甜菜主产区时常发生甜菜花叶病与黄化毒病的混合侵染，使受害症状进一步加剧，造成甜菜生产的严重损失[1]。甜菜花叶病在中国新疆、内蒙古、山西、河北和黑龙江等甜菜产区每年都有发生，感染植株自症状表现起，块根产量每周降低2%～2.1%[2]。收获期测糖，病株含糖率平均降低3～3.4个百分点，经荧光检测，叶片叶绿素含量降幅高达59%[3]。近年来，又相继出现了关于甜菜花叶病毒感染和危害生菜及鹰嘴豆等其他作物的报道[4-5]。Moran等（2002）、M.Glasa等（2003）、L.G.Nemchinov等（2004；2015）、Haiying Xiang等（2007）分别从流行于澳大利亚、斯洛伐克、美国和中国的甜菜花叶病毒中分离获得BtMV基因序列[6-9]。

为进一步了解和分析发生和流行于我国的甜菜花叶病毒基因的结构与进化情况，本研究选取了部分同属于马铃薯Y病毒家族的植物病毒进行了研究与分析。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究的数据资料来源于NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）核酸及其氨基酸序列。

1.2 方法

将发生于我国的甜菜花叶病毒基因通过NCBI的Blast检索系统（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行序列的同源性分析，然后从中选取相关的马铃薯Y病毒基因家族序列，采用ClustalX软件做初步的多序列匹配排列（Multiple Alignments），最后采用BioEdit软件进行系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 发生于我国的甜菜花叶病毒基因结构域及与其它病毒基因结构域位点的比较与分析

发生和流行在我国的甜菜花叶病毒基因全序列为9591bp，5’端有1个165 bp的非编码区，编码3085个氨基酸，依次构成了P1 protein（313aa）；HC-protein（457 aa）；P3-protein（347aa）；6K1-protein（52aa）；CI-protein（634aa）；6K2-protein（52aa）；Vpg-protein（191aa）；NIa-protein（247aa）；Nib-protein（516aa）和Coat protein（276 aa），详见图1。甜菜花叶病毒蛋白含有高度保守的结构功能区，在马铃薯Y病毒属家族蛋白组成结构中，锌指蛋白结构域和PTK结构域参与蚜虫的互动传播，位于甜菜花叶病毒蛋白P3多肽的340～371 aa和HC蛋白的622～624aa残基分别为锌指蛋白结构域和PTK结构域；493～496aa是FRNK结构域，其功能是响应蚜虫的传播和表现病症；CI蛋白属于RNA解旋酶的第二大族群，在结构域的1254～1262aa是GAVGSGKST序列，其功能是绑定NTP。另6个解螺旋结构功能域分别是位于1277～1283 aa的LEPTRPL结构域；位于1343～1346 aa的DESH结构域；位于1369～1376 aa的LKVSATPP结构域；位于1420～1423 aa的LVYV结构域；位于1472～1483 aa的VATNIIENGVTL结构域和位于1516～1527 aa的GERLQRLGRVGR结构域。甜菜花叶病毒Nib蛋白具有马铃薯Y病毒多肽典型的保守功能域GNNSGQPSTVVDNTLMV（2600~ 2616 aa）and GDD（2644～2646 aa）以及与其相应的更大的SG-(X)3-T-(X)3-NT-(X)30-GDD结构域，其为依赖于RNA聚合酶的RNA活性位点。

通过与花生斑驳病毒（Peanut mottle virus）、菜豆黄花叶病毒（Bean yellow mosaic virus）基因编码的蛋白比较，花生斑驳病毒蛋白含有3099个氨基酸，链接10个结构域的9个位点分别是IHQY/S；YVVG/G；VVYQ/ A；VRYQ/S；VQYQ/S；VRYQ/G；VATE/G；VEYQ/S；VRYQ/S。菜豆黄花叶病毒的链接10个结构域的9个位点分别是IREF/S；YRVG/G；YTFQ/A；YRFQ/S；LQFE/S；FVFQ/G；FDFE/S；LSFQ/S；CRFQ/S，而甜菜花叶病毒的链接结点分别为TMHY/S；YRVG/G；VEYQ/A；VKYQ/S；VQYQ/G；VQYQ/G；VREE/G；VVEQ/G；VTYQ/G（见图1）。关于结构域的链接结点的差异是否事关传播媒介的选择，目前还不得而知。

图1 3种不同病毒结构蛋白的氨基酸切割位点比较Fig.1 Amino acid cleavage sites comparison of BtMV(Beet mosaic virus)with PeMoV(Peanut mottle virus)and BYMV(Bean yellow mosaic virus)

2.2 我国甜菜花叶病毒基因与其它国家甜菜花叶病毒基因的亲缘关系分析

为明确我国甜菜花叶病毒与其它国家甜菜花叶病毒的亲缘关系，采取BioEdit软件对流行在我国的甜菜花叶病毒与美国、澳大利亚（同英国）、斯洛伐克等地的BtMV生理小种做了遗传发育进化树分析（见图2），从图中可以看出，发生和流行于我国的甜菜花叶病毒生理小种1与英国和斯洛伐克的近缘；而生理小种2与发生在美国的BtMV具有较近的亲缘关系。

图2 发生在我国的甜菜花叶病毒与其他国家的BtMV亲缘关系比较Fig.2 Genetic relationship of Chinese BtMV with that of other countries

2.3 我国甜菜花叶病毒与其它马铃薯Y病毒属家族的系统进化分析

甜菜花叶病毒与花生斑驳病毒编码多肽的同源性达55%[同8]，为了明确甜菜花叶病毒与同属马铃薯Y病毒属家族的进化关系，本文通过NCBI对BtMV进行了目标性的BLSTp分析，从中选取了21个经Blast比对后高度同源的序列（详见表1），将其相对应的种作为外类群，构建了甜菜花叶病毒的系统发育进化树。

图3是经BioEdit软件完成的系统进化树，该进化树显示以上22种病毒分属于三大族：芋花叶病毒NC003537、西葫芦黄花叶病毒NC003224、菜豆坏死病毒NC004047、豇豆蚜传花叶病毒NC004013、东亚西番莲病毒AB690452、豹纹蝶Y病毒NC010954、紫藤脉花叶病毒NC007216、大豆花叶病毒NC002634、西瓜花叶病毒NC006262、菜豆普通花叶病毒NC003397、花生条纹矮化病毒PSU34972和鱼腥草花叶病毒NC009742为一族。其中豹纹蝶Y病毒NC010954、紫藤脉花叶病毒NC007216、大豆花叶病毒NC002634高度近缘；第二族由甜菜组（图中椭圆内区域）与落葵皱纹花叶病毒NC009741以及和平莲花叶病毒NC009743和花生斑驳病毒NC002600、香雪兰花叶病毒NC014064组成，落葵皱纹花叶病毒与和平莲花叶病毒高度同缘，花生斑驳病毒和香雪兰花叶病毒近缘；第三族包括香蕉苞片花叶病毒NC009745；洋葱黄矮病毒NC005029；菜豆黄花叶病毒BYU47033；辣椒斑驳病毒NC001517和芜菁花叶病毒NC002509。其中辣椒斑驳病毒和芜菁花叶病毒相对近缘。

表1 用于多序列比对的其它马铃薯Y病毒属及序列[10-25]

从图3中可以看出，甜菜花叶病毒组与落葵皱纹花叶病毒以及和平莲花叶病毒处于同一支脉，说明甜菜花叶病毒与落葵皱纹花叶病毒、和平莲花叶病毒较近缘。另花生斑驳病毒和香雪兰花叶病毒与甜菜花叶病毒、落葵皱纹花叶病毒及和平莲花叶病毒同处一族。

为进一步明确甜菜花叶病毒（DQ674264）与落葵皱纹花叶病毒（NC009741）以及和平莲花叶病毒（NC009743）和花生斑驳病毒（NC002600）、香雪兰花叶病毒（NC014064）的结构域相似性，采用BioEdit软件对5条蛋白质序列进行了比对分析，经过氨基酸序列比对发现，甜菜花叶病毒与其他病毒的主要氨基酸差异在CP功能域，P3功能域序列相似度最高，不同病毒功能域的异同可以为抗不同病毒的基因工程操作提供思路。

3 讨论

病毒普遍存在于作物生产环境之中。截至2012年，国际病毒分类委员会（ICTV）报告了2619种病毒（ICTV Master Species List，2012 v2）[26]。甜菜花叶病毒是危害甜菜的世界性病害之一，寄主植物中的抗性机制取决于在基因相互作用中发挥作用的不相容基因，包括从寄主中获得的抗性（R）基因产物，以及从病原体中获得的相应的无毒基因产物。病毒外壳蛋白（CP）参与病毒生物学的多个方面，包括：衣壳化，病毒复制，细胞间或系统运动，以及介体传播和症状发展[27]。通过对甜菜花叶病毒蛋白保守的结构功能区的分析，锌指蛋白和PTK结构域、FRNK结构域的功能认知，CI蛋白RNA解旋酶的功能认知，以及依赖于RNA聚合酶的RNA活性位点分析，可为抗病毒的基因工程操作提供借鉴和指导。同时，研究甜菜花叶病毒的基因序列及其发育与进化，对发现和探求寄主植物的抗病性具有重要的现实意义。

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Comparison and Analysis of DNA Sequence of Beet Mosaic Virus(BtMV) from China and Other Members of Genus Potyvirus

DING Guang-zhou1,3,LI Yong-gang2,ZHAO Chun-lei1,3,WANG Xi1,3,ZHANG Yu-shuang1,3,LIU Na1,3, CHEN Li1,3,CHEN Lian-jiang1,3
(1.Sugar Beet Engineering Research Center of Heilongjiang Province/Heilongjiang University,Harbin 150080,China;2.College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;3.Sugar Beet Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080,China）

In order to understand the basics of a beet mosaic virus,we have compared DNA sequences of Beet mosaic virus(BtMV)endemic in China with those isolated from the US and Slovakia,including other virus belonging to genus potyvirus.The full-length sequence of BtMV isolated from China consists of 9,591bp,with encoding 3,085 amino acids,containing highly conserved functional domain of potyvirus.The polyprotein of BtMV isolated from China gives rise to ten proteins(P1,HC-pro,P3,6K1,CI,6K2,VPg,NIa,NIb and CP),and cleavage sites of each protein were compared with those of other known potyviruses.Phylogenetic tree of the polyprotein revealed that BtMV-china was the most close to BaRMV and PeLMV,and was related to PeMoV and FreMV.

beet mosaic virus;potyviruses;phylogeny

S435.663

A

1007－2624（2015）06－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2015.06.001

2015-06-10

国家自然科学基金项目“甜菜花叶病不亲和基因的克隆及抗病反应机制和遗传研究”(31171604)；本研究另由“中国博士后科学基金资助项目”（2012M520781）资助；黑龙江省博士后基金资助。

丁广洲（1972-），男，博士，副研究员，从事甜菜抗病遗传学与分子生物学研究。E-mail：dgz@hlju.edu.cn

陈连江（1957-），男，研究员，所长，主要从事甜菜遗传育种、栽培研究。E-mail：chen4004@163.com