唐纪伟 高庆华

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。自PCR技术问世以来，以其快速、准确、敏感和简便等优点在医学、微生物学和胚胎移植前遗传学诊断(PGD)等领域得到了广泛的应用［1－3］。现在，PCR技术已被广泛应用于牛、羊等动物的胚胎性别鉴定，还建立了许多基于PCR技术的家畜胚胎性别鉴定方法。随着研究的进一步深入，要求PCR性别鉴别技术在原有基础上更加快速、敏感和简捷。巢式PCR法是在PCR技术的基础上发展起来的，它是根据一个性别特异基因设计一对外引物以得到被测基因较长的扩增产物，再根据扩增产物序列设计第二对引物(内引物)对产物进行第二次扩增。巢式PCR经过两次扩增，使扩增产物的量增加，结果更容易判断，同时巢式引物的使用增加了扩增产物的特异性，提高了准确度［4］。

本实验采用巢式PCR扩增超微量山羊血液基因组DNA进行性别鉴定，旨在建立超微量DNA检测方法，在对家畜早期胚胎进行鉴定时，尽可能少的切取胚胎，以减少对胚胎的伤害，提高胚胎移植的成功率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2×HSTMTaq mix(广东东盛公司)、TaKaRa DL－2000 DNA marker、琼脂糖(大连宝生物公司);AB2400型PCR仪、DYCP－31BM型水平电泳槽(北京六一仪器厂)、JY－ECPT3000型稳压稳流电泳仪、凝胶成像仪;血液样品(采自阿克苏地区当地山羊)。

1.2 引物设计

根据羊AMEL基因序列，采用BLAST和Clustal W程序设计巢式引物，巢式外引物(amelF1:5'－CATGGT GCCAGCTCAGCAG －3'和 amelR1:5'－CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC－3')，巢式内引物(amelF2:5'－CAGCAACCAATGATGCCAGTTC－3'和amelR2:5'－GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA －3')，两对引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 DNA提取、稀释及PCR扩增

1.3.1 血液基因组DNA的提取

山羊血液样……