张立强等

摘 要 从海南省尖峰岭热带雨林土壤中分离获得143株芽孢杆菌。经松材线虫初筛，获得8株拮抗活性在80%以上的菌株；经南方根结线虫二龄幼虫（J2）复筛，获得4株拮抗活性在50%以上的菌株，其中菌株DB13184的发酵上清液稀释10倍后，校正死亡率仍有56.7%。基于16S rDNA系统发育分析，显示菌株DB13184属于芽孢杆菌属，与菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T的序列相似度达100%，二者在系统发育树上亦处于同一分支；结合该菌的培养特征、形态特征及生理生化特征，将其鉴定为Bacillus toyonensis。

关键词 根结线虫；热带雨林；芽孢杆菌；活性筛选；鉴定

中图分类号 Q939.9 文献标识码 A

Abstract A total of 143 strains were isolated from Jianfengling tropical rain forest soil in Hainan Province. After first screening， eight isolates with antagonism activities more than 80% against pine wood nematode were obtained. Four isolates with antagonism activities more than 50% against second-stage juveniles（J2） of Meloidogyne incognita were obtained after second screening. The corrected mortality of the fermentation supernatant of strain DB13184 diluted 10 times was 56.7%. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence showed that the strain DB13184 belonged to genus Bacillus， and closely related to B. toyonensis BCT-7112T with the highest 16S rRNA gene similarity of 100%. In the phylogenetic tree， the two strains located on the same branch. Based on the culture characteristics， morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics， strain DB13184 was identified as Bacillus toyonensis.

Key words Root-knot nematodes；Tropical rain forest；Bacillus；Active screening；Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.027

根结线虫是一类严重危害农业生产的植物病原线虫，广泛分布于世界各地，可侵染3 000多种分属于114个科的植物[1]。据估计，在世界范围内每年由于根结线虫等植物寄生性线虫而造成的损失超过1 200亿美元[2]。目前，化学杀线虫剂仍然是防治根结线虫的主要手段，但这种方法破坏环境、危害人体健康，正逐渐被限制使用；而传统的一些防治方法如轮作、休耕等有时不易被实施。生物防治以其安全、高效、无污染的特点正越来越受到重视，是根结线虫未来防控策略中的主要方向之一。

芽孢杆菌在自然界各种生境中广泛存在，种类繁多，遗传类型多样。研究结果表明，其对多种病原性真菌、线虫、细菌有拮抗活性，有些已经广泛用于病虫害的防治，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等[3]。此外，芽孢杆菌营养要求简单，在环境中很容易存活、定殖，其最突出的优势是能产生抗逆性强的内生孢子，将其开发成生防制剂具有制作简单、施用方便、储存期长等优点，是最理想的生防菌[4-5]。目前，国内外已经报道的对根结线虫具有拮抗活性的芽孢杆菌种类达14种，研究较多的有苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）[6]、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）[7]和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）[8]等，并在线虫的防治方面显示出了很大的潜力。但在实际应用过程中，由于大田环境的复杂性，这些生防菌剂的效果通常不够理想[9]，因此，进一步寻找抗根结线虫的芽孢杆菌新菌株仍然是必要的。

海南省独特的地理位置造就了海南省独特的、复杂多样的生态系统，是生防资源筛选的宝贵资源库。尖峰岭热带雨林（108°44′～109°02′ E，18°23′～18°52′ N）位于中国海南省乐东县，是中国现存面积最大、保存最好的原始热带雨林，被誉为“热带北缘生物物种基因库”。目前，关于尖峰岭热带雨林抗根结线虫芽孢杆菌的研究尚未见报道，本研究拟对该区域中的芽孢杆菌进行分离、筛选，旨在为进一步的生防研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2012年7月8日在海南省尖峰岭热带雨林采用5点取样法，去除表面杂物后，取深度25 cm内的表层土，将5个采样点的土样等量混合并翻拌均匀，装入无菌样品袋，带回实验室及时处理。

1.1.2 培养基 分离培养基：营养琼脂：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化钠5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.5；麦芽汁营养琼脂：麦芽汁（波美度7°）琼脂与营养琼脂分别灭菌，等量混合倒平板；SYD培养基：可溶性淀粉3 g，蛋白胨10 g，酵母粉3 g，葡萄糖3.5 g，KH2PO4 1.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.5。

纯化培养基：营养琼脂。

发酵培养基：营养肉汤（配方同营养琼脂，不加琼脂粉）。

1.1.3 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒购自成都福际生物技术有限公司，2×Es Taq MasterMix（PCR用）购自北京康为世纪生物科技有限公司，细菌通用引物（27F、1492R）由上海生物工程有限公司合成，其他常用试剂为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌的分离 取土壤样品10 g，放入盛有90 mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，200 r/min振荡30 min后，配制成10-2～10-6系列梯度的土壤悬液，80 ℃水浴处理20 min。分别吸取不同稀释梯度的土壤悬液100 μL，在不同的分离培养基上涂布，每种培养基3个重复。30 ℃恒温培养2～4 d后，根据菌落的大小、颜色、形状、边缘、凸凹度、透明度、光泽度等表面特征，选取单菌落，在纯化培养基上划线2～3次，以获得纯培养。经芽孢染色验证后，编号，于-70 ℃甘油保存。

1.2.2 菌株的液体发酵 挑取经活化的单菌落接种发酵培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养48 h，发酵液10 000 r/min离心10 min，取上清液，于4 ℃保存备用。

1.2.3 抗根结线虫活性菌株的筛选 初筛：以松材线虫为靶标，松材线虫的获取参照雷敬超[10]的方法进行。在1.5 mL离心管中加入发酵上清液450 μL，线虫悬液50 μL（约100条），每个处理3次重复，以发酵培养基为对照，28 ℃放置24 h后，2 000 r/min离心2 min，去上清，剩余约20 μL，重悬线虫。以NaOH法判定线虫死亡与否[11]，将线虫液吸取到载玻片上，并按1/5的体积加入0.5 mol/L的氢氧化钠溶液，迅速于显微镜下观察，2 min内依然呈线状的线虫记为死亡，弯曲状的记为存活，计算校正死亡率，计数3次取平均值。

校正死亡率/%=100×（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）

复筛：以南方根结线虫（由本实验室鉴定并传代保存）二龄幼虫（J2）为靶标，J2的获取参照魏华[12]的方法进行。将发酵上清液稀释10倍，处理方法同初筛。以清水复活法判定线虫的死亡与否，将线虫重新放入1 mL的清水中，28 ℃放置24 h，2 000 r/min离心2 min，去上清，剩余约20 μL，重悬线虫，镜检，若线虫依然呈线状的判定为死亡，弯曲状的则判定存活，计算校正死亡率，计数3次取平均值。

活性菌株的遗传稳定性：将活性菌株在营养琼脂平板上连续5次划线继代培养，并测定每一代菌株的抗根结线虫的活性，方法同上，计算校正死亡率。

1.2.4 活性菌株的鉴定 （1）培养及形态特征：取待测菌株，在营养琼脂平板上划线，30 ℃培养24 h后，对长出的菌落进行观察，包括大小、形状、颜色、边缘、凸凹度、透明度及菌落表面是否光滑、湿润、有光泽等，连续观察7 d。按照东秀珠[13]的方法进行革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色及伴孢晶体染色，最后对菌体特征进行观察。

（2）生理生化特征：菌株的M.R试验、V-P试验、吲哚试验，柠檬酸盐利用、耐盐性、淀粉水解、明胶液化、酪素水解、接触酶、苯丙氨酸脱氨酶、卵磷脂酶、酪氨酸水解、硝酸盐还原、糖醇发酵（D-葡萄糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、纤维二糖、D-松二糖）等特征参照东秀珠[13]和Paul等[14]的方法进行。

（3）16S rDNA序列测定及其系统发育分析：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。以此DNA为模板，采用细菌通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rDNA序列PCR扩增。PCR反应总体系为50 μL，其中基因组DNA 3 μL，27F 2 μL，1492R 2 μL，2×Es Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 18 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。所得产物检测合格后，送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果在EzBioCloud数据库（网址：http：//www.ezbiocloud.net/）中进行比对，采用ClustalX 2.1软件进行多序列分析，采用MEGA 5.0软件（N-J法）构建16S rRNA基因系统发育树[15]。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离及筛选结果

由图1可知，本实验共分离到143株芽孢杆菌，经初筛获得8株校正死亡率在80%以上的菌株，将发酵上清液稀释10倍后进行复筛，结果共获得根结线虫校正死亡率在50%以上的菌株4株，其中菌株DB13184对线虫的校正死亡率为56.7%，并且连续5次继代培养后，其对线虫的活性为57.8%，说明该菌株具有稳定的线虫拮抗活性。

2.2 菌株DB13184的鉴定

2.2.1 培养及形态特征 菌株DB13184在营养琼脂平板上生长迅速，菌落近圆形、白色、边缘不整齐、表面湿润粗糙、稍突起、不透明，菌落直径为0.5～3.0 mm（图2）；培养7 d后，形成扁平状菌苔，形状不规则，表面粗糙，颜色灰白，无光泽。

菌体杆状，呈链状排列，革兰氏染色阳性（图3）；产椭圆形芽孢，胞囊不膨大，近中生，具有鞭毛，无伴孢晶体。

2.2.2 生理生化特征 由表1可知，菌株DB13184的M.R试验、V-P试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用为阳性，能水解淀粉、明胶、酪素；接触酶、卵磷脂酶、酪氨酸水解试验为阳性，苯丙氨酸脱氨酶为阴性，能还原硝酸盐，能利用葡萄糖、松二糖产酸，不能利用果糖、阿拉伯糖、甘露醇、纤维二糖产酸，能耐受5%（w/V）的NaCl溶液，不耐受7%（w/V）的NaCl溶液。

2.2.3 16S rDNA序列测定及系统发育分析 测序获得菌株DB13184的16S rDNA序列为1 403 bp，NCBI登录号为KJ721162。经在EzBioCloud网站比对，结果发现与其相似度较高的菌株均为芽孢杆菌属（Bacillus），与Bacillus toyonensis BCT-7112T相似度最高（100%），其次是Bacillus thuringiensis ATCC 10792T（99.9%）。按相似度高低选取相关菌株构建系统发育树（图4），菌株DB13184与B.toyonensis BCT-7112T、B.thuringiensis ATCC 10792T聚为一个分支，亲缘关系最近。

2.2.4 菌株DB13184的鉴定结果 基于16S rDNA的序列发育结果表明，菌株DB13184与Bacillus toyonensis BCT-7112T和Bacillus thuringiensis ATCC 10792T在系统发育树上聚为一支，但菌株DB13184与菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T具有更高的序列相似性，在1 403 bp长度上二者相似度为100%；在培养与形态特征方面，菌株DB13184不产生伴孢晶体，而苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）产生伴孢晶体；在生理生化特征方面，菌株DB13184能利用D-松二糖产酸，不能利用纤维二糖产酸，耐受5%的NaCl，与Bacillus toyonensis BCT-7112T[16]相一致。综合各方面的信息，将菌株DB13184鉴定为Bacillus toyonensis。

3 讨论与结论

据报道，土壤中可被培养的微生物仅占0.3%左右[17]。在本研究中，从海南尖峰岭热带雨林土壤中共分离到芽孢杆菌143株，但由于采样时间与地点影响、培养方法限制等原因，不可避免的有些种类无法被有效分离，真实的数量应该远不止于此。因此需要进一步优化分离培养技术，才能更为全面的获取其中的芽孢杆菌资源。

根结线虫是植物内寄生线虫，直接测定所分离菌株的拮抗活性存在很多困难，室内离体测定可以快速处理大量样品，筛选到目标菌株。研究结果表明，松材线虫具有多种毒素结合位点，能较为灵敏的检测到发酵液中抗线虫活性的物质[10]，并且培养简单、繁殖快，将其用于活性菌株的室内初筛，有助于提高实验效率，再结合根结线虫J2复筛，可有效获得抗根结线虫活性菌株。

将16S rDNA序列分析与培养特征、生理生化特征结合起来进行微生物的分类鉴定是一种快速有效的方法[18-19]，并且得到了广泛应用。在本实验中，经16S rDNA序列发育分析显示，菌株DB13184与菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T的序列相似度达100%，且在发育树上处于同一分支，再结合该菌的培养特征、形态特征及生理生化特征，并与菌株Bacillus toyonensis BCT-7112T的描述作比较，显示出相似的特征，最终将其鉴定为Bacillus toyonensis。

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