摘 要 根据胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌特异引物对，对采自中国云南、海南、广东和广西植胶区的138株炭疽病菌进行分子鉴定。结果显示：138株炭疽菌中鉴定为胶孢炭疽菌的有100株，占总测定株数的72.46%，尖孢炭疽菌的有38株，占总测定株数的27.54%。其中海南、云南和广东橡胶苗圃中胶孢炭疽菌占所分析菌株总数比例分别为81.82%（54/66）、60.0%（15/25）和77.27%（17/22），而广西3个橡胶苗圃中的2个苗圃地尖孢炭疽和胶孢炭疽病菌各占一半。总体来看，国内橡胶树苗圃地炭疽病病原菌仍以胶孢炭疽菌为主，部分苗圃同时存在胶孢和尖孢炭疽菌的危害。

关键词 橡胶树；胶孢炭疽；尖孢炭疽；种特异性PCR；分子鉴定

中图分类号 S432.4 文献标识码 A

Abstract Based on the previous study， the Colletotrichum gloeosporioides-specific primers CgInt/ITS4， and the Colletotrichum acutatum-specific primers CaInt2/ITS4 and CAF53/CAR356 were used for taxon-speific amplification to characterize the Colletotrichum species of 138 isolates from Colletotrichum leaf disease lesions on Hevea brasiliensis on the rubber nurseries in China. The results revealed that only 38 isolates belonged to C. acutatum， and 100 isolates to C. gloeosporioides. The rates of C. gloeosporioides on the nurseries in Hainan， Yunnan， Guangdong and Guangxi provinces were 81.82%， 60.0%， 77.27% and 52%， respectively. On the whole， the results indicated that C. gloeosporioides was the dominant species responsible for Colletotrichum leaf disease on H. brasiliensis plants in China.

Key words Hevea brasiliensis； Colletotrichum gloeosporioides； Colletotrichum acutatum； Species-specific PCR； Molecular identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.024

炭疽菌（Colletotrichum spp.）是一类重要的植物病原真菌，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，其寄主范围十分广泛，包括蔬菜、牧草、果树、花卉等数十种重要经济作物。炭疽菌引起的橡胶树炭疽病是橡胶树的一种重要叶部病害，可危害苗圃小苗、大田幼树直至成龄开割胶树，侵染嫩叶、叶柄、嫩梢和果实等部位，引起嫩叶脱落、嫩梢回枯和果实腐烂，甚至形成僵果挂在树上[1-2]。严重时会引起胶树的重复落叶和嫩梢回枯，推迟开割时间[3]。该病于1905年在斯里兰卡锡兰首次发现[4]。橡胶树炭疽病病原菌有胶孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Collectotrichum acutatum）2种。在植胶国中，多数认为胶孢炭疽菌为主要病原菌，如巴西、马来西亚、印度、印度尼西亚和泰国；部分国家报道是以尖孢炭疽菌为主要病原菌，如斯里兰卡[5]。

在我国，橡胶树炭疽病于1962年在海南国营大丰农场首次发现。目前该病在我国普遍发生[6]，早期研究结果表明，在我国该病致病菌为胶孢炭疽菌[3，7]，2008年发现有尖孢炭疽菌为害[8]。研究结果表明，两种炭疽菌在生物学特性、抗药性和菌落形态上均存在较大差异[9-11]。但国内植胶区炭疽病菌以哪个种为主，至今未见报道。笔者于2013年调查了我国橡胶树主要苗圃炭疽病的发生情况，并采集样品进行室内分离鉴定。本研究以所分离的138株炭疽菌为研究对象，依据胶孢和尖孢炭疽菌特异引物对，利用PCR方法，对炭疽病菌的种类和分布进行分析，为该病防治策略的制定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的138株炭疽菌为2013年笔者所在实验室从国内橡胶主栽区收集的病样中按照组织分离法进行分离获得，并用柯赫氏法则进行了致病性鉴定。各菌株及症状描述详见表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株形态观察 将各菌株分别接种于PDA平板上，置于28 ℃光照培养箱中培养。5～7 d观察记录菌落颜色、气生菌丝浓密或稀疏等情况。

1.2.2 分子鉴定

（1）菌丝收集和基因组DNA提取。炭疽菌培养参考林春花等[17]的方法。采用高通量样品组织研磨仪（TissuelyserⅡ，QIAGENR）小量提取待测菌株的基因组DNA，用盖玻片将平板上的菌丝刮下放入样品管中，每个样品管放入2颗研磨珠，加入800 μL CTAB提取液，将样品管放在适配器上（每个适配器最多可放96个样品），再将适配器拧紧到研磨仪活塞上，设置破碎时间5 min，2～3次。破碎完成后取出溶液，采用常规方法，用氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1）抽提两次，取上清，用无水乙醇沉淀基因组DNA。

（2）特异引物及PCR检测。根据文献报道，胶孢炭疽菌鉴定引物对为CgInt/ITS4（CgInt：5′-GGCC

TCCCGCCTCCGGGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCT

TATTGATATGC-3′）[13-14]，能扩增获得1条约450 bp的特异片段；尖孢炭疽菌鉴定引物对为CaInt2/ITS4（CaInt2：5′-GGGGAAGCCTCTCGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和CAF53/CAR356（CAF53：5′-GGGCAGGGGAAGCCTCTCG-3′、CAR356：5′-AGCGGTGCTTGAGGGTTG-3′），能分别扩增获得1条约490 bp和303 bp的特异片段[15]。

PCR反应体系：10×Buffer 2.5 μL， 10 μmol/L 引物一0.5 μL，10 μmol/L 引物二0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，模板DNA 0.5 ng，0.5 U/μL Taq酶0.2 μL，加ddH2O至总体积25 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 5 min，10 ℃ 保存，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测分析，观察记录结果。

2 结果与分析

2.1 菌株形态观察

本研究对2013年分离自我国橡胶主产区苗圃的138株炭疽菌（海南66株、云南25株、广西25株和广东22株）进行菌落形态观察。结果详见表1。

2.2 分子鉴定

利用特异性引物对CgInt/ITS4、CaInt2/ITS4和CAF53/CAR356分别对138株炭疽菌进行PCR扩增。将引物对CgInt/ITS4能扩增获得特异片段，而引物对CaInt2/ITS4和CAF53/CAR356扩增不出特异性片段的菌株鉴定为胶孢炭疽菌；反之则鉴定为尖孢炭疽菌（图1和表1）。根据鉴定结果，138株炭疽菌中鉴定为胶孢炭疽菌的有100株，占总测定株数的72.46%；尖孢炭疽菌的有38株，占总测定株数的27.54%。据此可以推测，国内主要橡胶树苗圃中以胶孢炭疽菌为优势种。

海南38个苗圃地中采集到的66株炭疽菌中，胶孢炭疽菌占81.82%（54/66），尖孢炭疽菌占18.18%（12/66）；其中的34个（占89.47%）苗圃发现有胶孢炭疽菌为害，11个（占28.75%）苗圃有尖孢炭疽菌危害，且乐东大安、白沙邦溪民营胶园、儋州两院五队、屯昌中建农场、琼海东红农场苗圃2、琼海东红农场苗圃3、万宁东兴农场、陵水什玲镇什也村8个橡胶苗圃同时存在尖孢和胶孢炭疽菌的危害。

云南16个苗圃中，胶孢炭疽菌占64.0%（16/25），尖孢炭疽菌占36.0%（9/25）。其中的11个（占68.75%）苗圃发现有胶孢炭疽菌危害，8个苗圃（占50.00%）有尖孢炭疽菌危害，3个苗圃地同时存在尖孢和胶孢炭疽菌的为害。说明云南橡胶苗圃与海南橡胶苗圃一样，以胶孢炭疽菌为优势种，但其尖孢炭疽菌为害比例要比海南的高。

广东5个苗圃中，胶孢炭疽菌占77.27%（17/22），尖孢炭疽菌占22.73%（5/22）。除了“广东农垦亚热带作物研究所”样品仅检测到胶孢炭疽菌外，其他4个苗圃地既检测到胶孢炭疽菌，也检测到尖孢炭疽菌。其中，在“湛江市南亚所2”苗圃地的一片病叶上既分离到胶孢炭疽菌也分离到尖孢炭疽菌。

根据病样症状类型差异，本研究在广西东兴农场3个苗圃地采集分离获得25株炭疽菌，其中胶孢炭疽菌占52%（13/25），尖孢炭疽菌占48%（12/25）；东兴农场2苗圃中分离到5个炭疽菌，其中胶孢炭疽有3株，尖孢炭疽为2株；另外两个苗圃地炭疽菌的胶孢炭疽和尖孢炭疽数量相同，各占50%。说明在广西东兴农场的橡胶苗圃中，炭疽菌的种群结构由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌按均等比例构成。

3 讨论与结论

炭疽病是普遍存在的植物病害，引起炭疽病的病原菌为炭疽菌属真菌，炭疽菌属下的种很多，2009年Hyde等在研究和整理文献的基础上，列出了66个合格的分类单元，还指出存在争议的19个种[16]。传统的炭疽属分类，是以形态学以及寄主范围分类为主。种的分类主要以分生孢子形态、附着胞形态、刚毛的有无、分生孢子梗和产孢细胞的形态大小，菌核、厚垣孢子的有无及形态等作为分类依据[17]。但由于炭疽菌种间形态特征差异微小和不稳定，该属中种的分类不统一。相对于形态学分类，分子分类能够反映物种间核苷酸序列最本质的差异，分类性状稳定而标准[18]。近年来，基于分子标记的系统学方法被广泛应用于该属真菌的分类。目前，已确定引起橡胶树炭疽病的病原菌有两种，分别为胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌。据报道，通过孢子形态、有性态有无、生长速率和菌落颜色可区分尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌[19-21]。但是对于无长期分类经验的学者来说，采用形态学方法对二者进行区分，在实践过程中常常无法准确鉴定。本研究根据前人工作基础，利用特异性引物对二者进行鉴定，方法准确、快速。

炭疽病是我国植胶区普遍发生的一种叶部病害。炭疽病菌存在较为丰富的遗传变异，且随着主栽品种的改变以及气候条件的变化，橡胶树炭疽病病原菌种群可能发生改变。本研究对我国海南、广东、广西和云南部分植胶区橡胶树炭疽病菌的种进行鉴定，每个苗圃采集多个样品，且对症状表现不同的样品均进行分离鉴定，其结果基本反应了我国橡胶树炭疽菌病原菌种类和分布的基本情况。云南省是我国橡胶种植主要种植地，本研究所收集的病样只覆盖云南省部分地区，其结果可能不能完全代表云南省橡胶树炭疽病病原菌分布情况，但也基本说明了所调查地的情况。广西橡胶种植地主要集中在东兴市，本研究对其3个苗圃地详细分析了炭疽病菌的种，显示主要病原菌为胶孢和尖孢炭疽菌两种。在海南、广东和云南省也显示部分苗圃地以尖孢炭疽菌为主。胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的抗药性不同[11]，所使用的防治药剂有所区别，本研究结果可为生产上科学合理用药提供参考依据。

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