刘晓妹等

摘 要 为了探明多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）毒素基因cc004-cas序列特征及其功能，以巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌为材料，采用SEFA-PCR和RT-PCR技术对毒素基因cc004-cas进行扩增，并通过插入潮霉素B基因获得其突变体。序列特征分析结果表明，cc004-cas基因DNA和cDNA全长分别为2 800 bp和180 bp，编码区含2个内含子（67 bp和49 bp），推测编码59个氨基酸，其分子量约为5.92 ku，等电点pⅠ为5.70，与NCBI中报道的C. cassiicola毒素基因cas编码的毒素前体pro-cassiicolin的氨基酸序列（0HABV25895.1）相似性达85%。cc004-cas突变体表型测定结果表明：在菌落和菌丝形态、生长，产孢量、孢子萌发，菌丝生长对温度、pH要求，产生漆酶和纤维素酶的能力方面与野生型无显著差异；但用菌饼接种橡胶树嫩叶，致病力略有下降，用粗毒素接种时，致病力明显减轻，可见毒素是多主棒孢菌的一个重要的毒力因子，但不是唯一的因子。

关键词 多主棒孢菌；毒素基因；克隆；致病力

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract To reveal the sequence features and the function of a toxin encoding gene cc004-cas，cc004-cas gene was cloned from Corynespora cassiicola on Hevea brasiliensis by the method of SEFA-PCR and RT-PCR，and its knockout mutant was gained by inserting hygB gene into cc004-cas gene. Analysis of sequence characterization showed that the complete DNA and cDNA sequence of cc004-cas gene was 2 800 bp and 180 bp in size， respectively， with two introns of 67 bp and 49 bp， respectively， encoding a putative protein of 59-amino acid with a molecular weight of 5.92 ku and isoelectric point of 5.70. Analysis indicated that the putative protein of cc004-cas gene was homologous to C. cassiicola cas toxin gene coding product-pro-cassiicolin（0HABV25895.1）with a similarity of 85% in NCBI. Phenotype changes of a cc004-cas gene mutant were tested and there were no obvious difference in the colony color， mycelia morphology and growth， sporulation quantity， conidial germination， requirement of temperature and pH， and laccase and cellulase production between the mutant and the wild type. However the young leaves of the rubber tree inoculated with mycelia plugs produced typical symptoms but demonstrated weak virulence. While crude toxin was tested for pathogenicity， it displayed weaker virulence. That indicated cc004-cas toxin was a impotant virulence factor but not a unique factor in the pathogenicity of C. cassiicola in Hevea brasiliensis.

Key words Corynespora cassiicolas；Toxin gene；Cloning；Pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.025

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科三叶橡胶树属，是热带经济作物之一，其产品天然橡胶与钢铁、石油、煤炭并列为四大工业原料。由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B.&C.）Wei]引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是国际上公认的继南美叶疫病之后的又一个为害巴西橡胶树的重要病害，2006年开始在中国胶苗上发生[1]，现已开始为害成龄的开割橡胶树[2]。早在1975年Onesirosan等[3]就发现多主棒孢菌能产生毒性物质。2000年Breton等[4]确定该毒性物质是一种蛋白物质，并定命为“Cassiicolin”。2007年De Lamotte等[5]确认Cassiicolin是一种寄主专化性毒素，凝胶电泳显示大小约15 ku，经色谱测定，Cassiicolin是一种由27个氨基酸组成的富含半胱氨酸的糖蛋白，分子量为2 885 ku，与现有数据库中的蛋白没有明显的同源序列。随后Cassiicolin的空间结构得到了确定[6]。2009年该毒素的抗体被获得[7]。中国也纯化出了该毒素，凝胶电泳显示大小为14.4 ku[8]。2011年Déon等[9]从分离自橡胶树C. cassiicola的致病力强和中等的菌株中克隆到了完全相同的Cassiicolin基因cas，大小292 bp，推测由58个氨基酸组成，并提纯到等量的毒素，但在弱致病力菌株中却未克隆到该基因，也未提纯到该毒素，进一步研究发现该菌株致病力的差异与该毒素性质无关，而与其转录水平有关，一般在接种后1～2 d转录水平达到高峰，Déon等[9]据此推测Cassiicolin毒素是C.cassiicola侵染寄主早期的重要致病因子。不同来源的多主棒孢菌在形态、生理特性及致病力等方面存在明显的差异[10]。或许来自国内橡胶树C. cassiicola的毒素基因与来自国外的也存在差异，且国内外尚缺乏从分子水平上敲除该毒素基因、对其功能进行确切鉴定的数据。因此，本研究对分离自国内巴西橡胶树C. cassiicola的毒素基因cc004-cas进行克隆和敲除鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病菌和品种 巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌多主棒孢菌[C.cassiicola（B.&C.）Wei]单孢菌株CC004[10]、巴西橡胶树感病品种RIM600，均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.2 试剂 Fungal gDNA Kit为BioMiga产品；pMD18-T simple Vector、1.5 U La-Taq DNA聚合酶、2×GC BufferⅠ（Mg2+ Plus）、2.5 mmol/L dNTPs为TaKaRa产品；2×Taq-Mixture Kit、Escherichia coli DH5α、TIANgel Midi Purification Kit和TIANScript cDNA First-Stand Kit为TIANGEN产品，RNA Extraction Kit为BioTeke产品；pCT74质粒由美国Oregon大学Ciuffetti博士提供；CloneEZTM PCR Cloning Kit为Script产品；DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ为Roche产品；潮霉素B为Roche进口分装，Ampicillin为Amresco进口分装；溶壁酶购自广东省微生物研究所；其它试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌菌丝收集与核酸提取 收集用PD液培养4～5 d的菌丝。按照BioMiga Fungal gDNA Kit提取总DNA。按照BioTeke RNA Extraction Kit提取总RNA。

1.2.2 从基因组DNA扩增cc004-cas基因片段 采用同源克隆法。参照GenBank：EF667973.1设计引物TL5 5′-CACAATGAAATATCTCCC-3′和TL6 5′-AAAGTTAACATCCCGAAC-3′。扩增体系（50 μL）：2×Taq-Mixture 25 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，总DNA 1 μL，加ddH2O补至50 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。将获得片段命名为cc004-cas。PCR产物的凝胶回收、连接、转化按照TIANGEN和TaKaRa相应试剂盒操作。

1.2.3 SEFA-PCR 获得cc004-cas基因DNA全长 参照SEFA-PCR（Self-Formed Adaptor PCR）引物设计原理[11]，根据已获的cc004-cas基因序列设计扩增5′端和3′端的引物。5′端引物：5TL1 5′-GCCACAGAACCCGTTGCCGAAATC-3′，5TL2 5′-AAGTCAAGACGTACGCAAGACTGTCTAGG-3′，5 Hemin-TL3 5′-CAGAGATGAAGATAGG，NNN，NNN，NNN，AGATA-3′；3′端引物：3TL1 5′-GTGCGGCAG

CAGCTATTCTTCCTAGACAG-3′，3TL2 5′-CGATTT

CGGCAACGGGTTCTGTG -3′，3Hemin-TL3 5′-AAG

CTAATTTGCAT，NNN，NNN，NNN，ACAGTG-3′。

SEFA-PCR第一步扩增。扩增体系（30 μL）：2×GC BufferⅠ（Mg2+ Plus）15.0 μL， dNTPs Mix（各2.5 mmol/L）5.0 μL， Hemi-SA3（20 μmol/L）0.5μL，gDNA 1.5 μL， La-Taq酶（1.5 U）0.5 μL，补ddH2O至30 μL。扩增条件： 94 ℃ 1 min； 94 ℃ 30 s， 40 ℃ 3 min， 以每秒增加0.2 ℃的速度升至70 ℃， 70 ℃ 5 min。取出PCR管加入0.5 μL引物SA1（20 μmol/L）后继续扩增， 扩增条件： 94 ℃ 30 s， 70 ℃ 5.5 min， 25个循环； 再进行8轮不对称扩增（94 ℃ 30 s， 70 ℃ 5.5 min，2个循环；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，1个循环）；70 ℃ 5 min。

SEFA-PCR第二步扩增。扩增体系（30 μL）：引物SA2（20 μmol/L）0.5 μL，模板为第一步扩增产物1.5 μL，其余同第一步。扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s（5′端）/65 ℃ 30 s（3′端），72 ℃ 5 min，33个循环；72 ℃ 10 min。

5′端和3′端第二轮扩增产物测序。由于所获得片段太长，难于克隆测序，所以本试验借助5′端或3′端引物TL2和Hemi-TL3之间的序列，设计了引物5TL4 5′-CTGCCGCAGCAGACGGACCCT-3′和3TL4 5′-CGACAACTGTGGTAATTCCTG-3′，分别做为5′端和3′端第二轮扩增产物的单向测序引物。

1.2.4 序列拼接与验证 利用DNAssist1.0软件将所得5′端和3′端序列与cc004-cas基因片段序列拼接获得其初步的全长序列。再从两端设计引物用高保真酶扩增、测序，验证已获得序列的正确性。

1.2.5 RT-PCR法扩增获得cc004-cas基因的cDNA 用DNAssist1.0软件对所得cc004-cas基因全长DNA与GenBank中cas基因的cDNA序列 （EF667973.1AB180104.1）比对分析后，用推定的cDNA序列设计引物对TR3 5′-TCTCCCTATCTTCA

TCTC-3′和TR4 5′-CCAGGAATTACCACAGTT-3′，按照TIANScript cDNA First-Stand Kit操作，扩增cc004-cas基因的cDNA并克隆、测序。

1.2.6 cc004-cas序列分析 利用DNAssist1.0软件比对分析所获得的cc004-cas基因DNA和cDNA序列，找出开放读码框、起始密码子、终止密码子、外显子、内含子。利用BioEdit软件分析cc004-cas基因编码序列的化学特征。用Primer5.0软件推测cc004-cas基因编码的氨基酸序列。用ExPaSy软件包中Computer PI/MW软件分析该蛋白序列组分。

1.2.7 cc004-cas基因敲除突变体获得及表型测定 线性化敲除载体的制备。将克隆有cc004-cas基因的pMD18-T simple Vector（命名p4CAS载体）用SalⅠ酶切，回收线性化载体p4CAS。

潮霉素B抗性基因。（hygB）的扩增与回收以pCT74质粒为模板，用引物HY3：5′-TAAAGGTA

TCATGTGAACTGGTTCCCGGTCGGC-3′和HY4：5′-AACCCGTTGCCGAAGAACTGATATTGAAGGAGCA

TTTTTT-3′（划线部分为p4CAS载体上SalⅠ酶切位点左右序列）扩增潮酶素hygB基因片段并回收。扩增体系同1.2.2。扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

敲除载体p4CASH的生成。按照GenScript Corporation CloneEZTM PCR Cloning Kit操作，线性化p4CAS载体和hygB基因片段连接，构建敲除载体p4CASH。

cc004-cas基因敲除突变体验证和RT-PCR分析。用敲除载体p4CASH转化多主棒孢菌原生质体，再生培养后共获得5个转化子，经多次单孢纯化后，先用扩增潮霉素hygB基因引物检测。选择编号为CTH5的突变体进行后续试验。用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切CTH5基因组DNA和野生菌株CC004基因组DNA进行Southern杂交验证，酶切图谱如图1；杂交探针扩增引物TProbe1：5′-CATTAGCGGATGAGTTAG-3′和TProbe2：5′-GGAT

ACAGAAAGCAAGAT-3′，预期大小约878 bp，用Roche产品DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ标记并杂交。为了进一步验证cc004-cas基因是否在突变体CTH5中正常转录，提取CTH5和CC004总RNA，以真菌18s rRNA通用引物的扩增产物作内参，以RT 1：5′-ATCTCCCTATCTTCATCT-3′ 和RT2：5′-GGAATTA

CCACAGTTGTC-3′为特异性扩增引物，参照1.2.5进行RT-PC分析。

cc004-cas基因敲除突变体表型测定。参照张贺等[12]研究方法，测定cc004-cas基因突变体CTH5在菌落和菌丝形态、生长，产孢量、孢子萌发，菌丝生长对温度、pH要求，产漆酶和纤维素酶能力及致病力方面变化。其中致病性测定选取巴西橡胶树感病品种RRIM600叶龄一致且完好无病斑的嫩绿色叶片，采用3种方法测定。（1）菌饼接种测定[12]：在每张嫩叶主脉每侧选3个侧脉轻轻刺伤，一侧接种野生菌株菌饼，另一侧接种突变体菌株菌饼，滴加40 μL灭菌水，28 ℃保湿培养，以接PDA琼脂饼做空白对照。 （2）粗毒素叶片穿刺接种测定：制备野生型或突变体粗毒素[12]；每个刺伤处仅接种40 μL粗毒素，用等量Czapek培养液做空白对照，逐日观察发病情况。 （3）粗毒素叶片萎蔫生物法测定[13]：将剪去叶柄的嫩叶称重（鲜重），插入盛有10 mL粗毒素原液的离心管中，用等量Czapek培养液作对照，室温培养至用野生型CC004毒素处理的叶片出现明显萎蔫时，取出叶片擦干称重（干重）。计算萎蔫指数[13]，确定毒素的致病力。每处理10片嫩叶。

2 结果与分析

2.1 cc004-cas基因克隆与序列分析

2.1.1 cc004-cas基因片段扩增结果 用引物TL5和TL6，以C. cassiicola总DNA为模板扩增获得了约300 bp片段（图2），测序后用Blastn分析，发现与cas基因（EF667973.1）的覆盖率和相似性分别达到100%和85%，说明获得的基因片段符合预期，定名为cc004-cas。

2.1.2 SEFA-PCR 获得cc004-cas基因DNA全长

通过SEFA-PCR 2步成功扩增获得cc004-cas片段上下游侧翼区域（图3）。测序表明：5′端和3′端侧翼序列长分别为837 bp和1 753 bp，与已获得cc004-cas序列拼接后，获得大小2 800 bp序列。

2.1.3 RT-PCR法扩增获得cc004-cas基因cDNA 经RT-PCR扩增获得约150 bp的cDNA片段（图4），测序表明大小为154 bp，与cas基因（EF667973.1）cDNA和cc004-cas基因的DNA序列比对拼接后获得cDNA全长180 bp。

2.1.4 cc004-cas序列分析 cc004-cas基因全长DNA与cDNA序列分析：比对分析cc004-cas基因DNA和cDNA序列，发现起始密码子ATG位于第802～804 bp处，终止密码子TAA位于第1 095～1 097 bp处，自ATG到TAA的DNA序列全长296 bp，存在3个外显子和2个内含子，外显子大小分别为105、60、15 bp（位于第802～906，974～1 033和1 083～1 097碱基处），内含子大小分别为67和49 bp（位于第907～973和1 034～1 082碱基处），所有内含子均符合GT-AG法则。

cc004-cas基因推测蛋白的化学特征分析：用Primer5.0软件推测cc004-cas基因编码59个氨基酸。用ExPaSy软件包中Computer PI/MW分析发现推测的cc004-cas毒素蛋白分子量为5.92 ku，包括2个强碱性氨基酸（KR），2个强酸性氨基酸（D），31个非极性氨基酸（AILMPWVF），24个极性氨基酸（NCQSTYHG），等电点（PI）为5.70，可见是一种酸性蛋白质，相对富含非极性氨基酸，其中丙氨酸（Ala，A）的含量最高，达18.64%；而极性氨基酸中半胱氨酸（Cys，C）、甘氨酸（Gly，G）和丝氨酸（Ser，S）的含量均为10.17%，居其次。

cc004-cas基因预测蛋白的同源性分析：利用NCBI网站中的BLASTP软件，对该推定的氨基酸序列进行同源性比对，发现与C. cassiicola pro-cassiicolin（0HABV25895.1）的氨基酸序列相似性达85%（图5）。因此初步确定本试验获得的cc004-cas基因是预期的C. cassiicola毒素基因，序列已提交GenBank（GU373809.1）。

2.2 cc004-cas基因敲除突变体的验证与表型测定

2.2.1 cc004-cas基因敲除突变体的验证 PCR验证表明（图6）：用检测潮霉素基因的引物从6个突变体基因中均扩增出了预期大小的条带（1 412 bp），从野生型基因组中未扩增到任何条带，说明hygB基因已插入转化子；Southern杂交验证表明（图7-A），突变体产生了1条与预期（2 118 bp）相符的杂交带，而野生型产生了1条710 bp杂交带，二者大小相差约1 400 bp，进一步确定hygB基因插入了毒素cc004-cas基因中，成功获得了cc004-cas基因敲除突变体。RT-PCR分析显示：在野生型中能扩增到了152 bp大小的特异性条带，而在CTH5突变体中无该条带，表明cc004-cas基因在突变体中无法正常转录表达（图7-B）。

2.2.2 cc004-cas基因敲除突变体表型测定结果 与野生型相比，cc004-cas基因突变体在菌落和菌丝形态、生长，产孢量、孢子萌发，菌丝生长对温度、pH要求，产生漆酶和纤维素酶能力没有明显变化。致病力测定如下：

（1）刺伤接种菌饼表明：野生型CC004与突变体CTH5的发病过程基本一致，即2 d后在接种点可观察到明显的坏死线，3 d后坏死线继续扩展，且在接种点叶背出现少量灰白色菌丝体（图8-A），4 d后坏死斑继续扩大并出现黄色晕圈，突变体病害平均严重度为2.38，略低于野生型2.76。用PDA琼脂饼接种的空白对照未表现任何症状。表明毒素基因突变体菌饼的致病力虽有减弱，但仍很强。

（2）粗毒素叶片穿刺接种表明（图8-B）：取40 μL粗毒素滴于感病品种RRIM600嫩绿色叶片的刺伤处，保湿培养4 d后，用野生菌株CC004粗毒素接种的部位出现坏死斑点，坏死斑周围的叶脉组织也呈现黑色坏死，形成了“鱼骨”状坏死线；用毒素突变体CTH5粗毒素接种的部位也有坏死斑点，但“鱼骨”状坏死线无或不清晰；用Czapek培养液接种的空白对照未表现任何症状；说明毒素突变体CTH5所产生的毒素对叶片的毒力作用显著下降。

（3）粗毒素叶片萎蔫生物测定法（图8-C）：将淡绿色叶片插入Czapek培养液，室温下放置4 d后，少部分叶片出现轻微萎蔫和变色，大部分仍正常；但插入野生型CC004和毒素基因突变体CTH5粗毒素液中的淡绿色叶片，2 d后大多数叶片的主脉基部开始变黑，4 d后叶片明显萎蔫，而突变体CTH5粗毒素处理的叶色失绿和萎蔫程度明显较轻，萎蔫指数为7.60%，约为野生型CC004（32.40%）的1/4，可见毒素基因突变体CTH5产生的粗毒素毒力显著下降。

3 讨论与结论

Déon等[9]从分离自橡胶树的C. cassiicola强致病力菌株和中等致病力菌株中克隆到了完全相同的Cassiicolin基因cas，在弱致病力菌株中却未克隆到该基因。本试验参考Cassiicolin基因设计引物，从分离自中国橡胶树C. cassiicola的强致病力菌株cc004中克隆到了毒素基因cc004-cas，但与cas基因存在一些差异，cc004-cas基因自ATG至TAA的DNA编码序列大小296 bp，比cas基因多了4个碱基，有43个位点存在差异，二者DNA相似性为85%；所得cDNA全长180 bp，比cas基因cDNA序列多了3个碱基，有22个位点有差异，二者cDNA相似性为88%；所推测编码的氨基酸59个，比cas基因编码的氨基酸在第26位多了1个丙氨酸，且有9个位点（第7、18、21、25、26、28、29、34和40氨基酸处）有差异，二者氨基酸相似性为85%。显示出毒素基因cas在不同菌株中存在一定的差异性，可能与不同菌株进化过程中在这些位点发生了变异有关。

从遗传研究来看，目前研究较深入的HC-毒素[14]、HMT毒素[15]和AK-毒素[16]等的合成涉及到多个成簇基因，因此推测除了cas基因外，cassiicolin毒素的合成或许也是由基因簇控制的，其它相关基因还有哪些？这些基因在cassiicolin素毒合成过程中如何起作用？这些问题需进一步研究。

另外，本研究还获得了该菌株的蛋白激酶CCK1突变体，测定致病力对比发现与毒素突变体引发的症状差异较大。（1）用菌饼接种刺伤的嫩叶时，CCK1突变体完全失去了致病力，毒素突变体却表现出略弱于野生型的致病力。（2）用粗毒素测定致病力时，毒素突变体引发的症状最轻、蛋白激酶CCK1突变体次之、野生型最重，萎蔫指数分别为7.60%、19.47%和32.40%，说明毒素是C. cassiicola重要的致病因子；在野生菌株中蛋白激酶CCK1调控毒素的产生，这与其它病菌中蛋白激酶如玉米小斑病菌CHK1[17]、玉米大斑病菌STK1[18]和柑橘褐斑病菌（A. alternata）AaSLT2[19]调控毒素产生的报道一致。不同接种方法产生如此大差异的原因可能有2方面：一是毒素并非是C. cassiicola唯一的致病因子，可能在菌丝生长过程中还分泌了其它致病因子；二是蛋白激酶CCK1在C. cassiicola与寄主早期识别过程中可能起着重要作用。这样，（1）用菌饼接种时，CCK1突变体因为缺失蛋白激酶而不能识别寄主，胞外信号传导中断，毒素及其它致病因子不能表达，因此失去了致病力；而在毒素突变体中毒素基因虽然被破坏，但蛋白激酶CCK1正常，病原菌能识别寄主，其它致病因子能正常合成和分泌，只是致病力因毒素被破坏而减弱。 （2）用粗毒素液接种时，不存在病原菌与寄主的识别，只有累积的毒素和其它致病因子对寄主的损伤作用；对于CCK1突变体，因缺失CCK1的调控而减弱了毒素合成或分泌能力，但能正常分泌其它致病因子（甚至分泌更多的漆酶和纤维素酶，尚未发表），所以致病性虽有下降，但仍能致病；对于毒素突变体，毒素合成受阻，但其它致病因子表达正常，所以其毒素粗提液仍能致病，但致病力因缺少毒素而更低。总之，C. cassiicola感染寄主使其发病的程度，可能由蛋白激酶CCK1调控下的病原菌与寄主的识别、侵入、产生的毒素及其它致病因子共同来决定。

SEFA-PCR技术是王世明博士发明的一种快速扩增某已知DNA序列侧翼序列的有效方法[11]。但缺点是有时因获得片段过长，不易克隆测序，又因第二轮扩增获得的序列两端反向互补，也无法用第二轮扩增引物进行PCR产物测序。本次试验巧妙地通过在用于SEFA-PCR的第二个和第三个引物序列之间、设计了1个单向测序引物克服了这一难题，使得通过SEFA-PCR技术顺利获得已知DNA序列的侧翼序列变得更加容易。

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