韩丽晓等

摘 要 用含质粒pYF8631的根癌农杆菌EHA105菌株转化‘巴西香蕉（Musa AAA Cavendish subgroup cv.‘Brazil）的假茎横切薄片， 在含有250 mg/L卡那霉素和500 mg/L羧苄青霉素的MS培养基上诱导不定芽， 获得5株GUS阳性苗。经PCR、RT-PCR检测，发现其中2株可以合成ALAS mRNA，表明YHem1基因已经整合到基因组中并且能够正常表达。测定香蕉内源ALA含量、ALAS活性和叶绿素相对含量（SPAD）表明，转基因植株具有ALAS活性，其ALA含量和叶绿素含量均显著高于野生型对照。7 ℃低温处理后的叶绿素快速诱导荧光动力曲线测定表明，转基因香蕉叶片光合电子转换能力显著高于野生型，表明转化YHem1基因可以提高香蕉耐冷性。

关键词 5-氨基乙酰丙酸（ALA）；YHem1；香蕉；遗传转化；叶绿素快速荧光动力学；低温胁迫

中图分类号 S668.1 文献标识码 A

Abstract The thin slices of pesudostems of banana（Musa AAA Cavendish subgroup cv.‘Brazil）were used as the explants to transform YHem1 gene by Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring pYF8631 plasmids and 5 GUS-positive regenerated buds were obtained on MS culture media containing 250 mg/L kanamycin and 500 mg/L carbenicillin. PCR and RT-PCR detection showed that two of them were transgenic， because only they could synthesize mRNA. Furthermore， they could biosynthesize more endogenous ALA due to the additional ALAS activity， with higher SPAD than the wild type. The detection of the chlorophyll fast induction fluorescence of banana leaves treated by 7 ℃ chilling showed that over-production of ALA in YHem1 transgenic banana might improve cold tolerance of banana in photosynthetic electron conversion ability. Thus， YHem1 transformation can improve chilling tolerance for banana plants.

Key words 5-Aminolevulinic acid（ALA）； YHem1； Banana； Genetic transformation； Chlorophyll fast induction fluorescence； Cold stress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.001

香蕉是世界上最重要的热带水果之一。据统计，2009年中国香蕉种植面积为33.8万hm2，产量为883.39万t[1]，主要分布在华南，包括广东、海南、广西、福建、云南、台湾等年均气温达21 ℃以上地区。尽管这里常年温度高，但即使在最热的海南省，每年冬春季都会受到寒流侵袭，有的年份还造成毁灭性伤害[2]。因而，冬春防寒是香蕉栽培的重要方面[3-4]。最近，黄芳等[5-6]提出，施用一定浓度外源5-氨基乙酰丙酸（ALA）可以显著提高香蕉幼苗抗冷性。但至今还没有通过转基因手段来获得抗寒香蕉新种质的研究报道。

ALA是所有卟啉化合物生物合成的关键前体，作为植物叶绿素合成研究的一个部分，很早就受到重视[7]。近年来，人们发现它在农业生产上有着重要的应用前景[8]，其中，最重要的是提高植物抗逆性。据报道，将三叶龄水稻幼苗根系浸泡在1 mg/L ALA溶液中24 h，转放于5 ℃低温中5 d，幼苗存活率、干物质重等显著提高[9]。用10 mg/L ALA处理甜瓜幼苗，经4 ℃低温6 h后，处理植株仅有部分叶片叶缘出现失水症状，且常温后可以逐渐恢复，但对照植株全部死亡[10]。在植物体内，ALA合成通过C5途径，由谷氨酸作为前体，需要三步生化反应，涉及多个基因；在动物和微生物（如酵母）体内，ALA合成通过C4途径，经甘氨酸和琥珀酰CoA缩合而成，由一个ALA合酶（ALAS）基因（HemΙ）控制。张治平等[11]将酿酒酵母ALAS基因与拟南芥HemA启动子（一种光敏型启动子）构建在一起，形成一种光诱导重组基因（YHem1）。通过LBA4404菌株介导转入拟南芥[12-13]、烟草[11-12，14]、草莓[15]后，转基因植株叶片可以在光照下合成更多内源ALA，而且光合能力、耐盐性等都显著提高。因而，通过遗传转化方式提高植物内源ALA合成能力有望培育出抗逆性强的植物新种质。为此，本研究将YHem1载体导入EHA105菌株，利用该菌株较强的浸染力[16]，通过根癌农杆菌介导法[12]将YHem1转入‘巴西香蕉中，经过优化遗传转化体系，获得转基因植株，并且证明，转YHem1基因香蕉幼苗具有更强的耐冷性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘巴西香蕉（Musa AAA Cavendish subgroup cv.‘Brazil）试管苗，由本实验室保存。

1.1.2 农杆菌 含有ALA合酶重组YHem1基因载体（图1）的EHA105农杆菌株，由本试验室保存。该重组基因由拟南芥HemA基因启动子和酿酒酵母HemΙ基因组成。转入植物后可以在光照下大量表达，而在黑暗中保持较低表达水平[11]。

1.2 方法

1.2.1 香蕉再生植株的获得 将切好的香蕉横切薄片接种到添有2 mg/L的AgNO3、0.1 mg/L NAA与3 mg/L 6-BA的MS培养基（MSo）上，暗培养2周。然后转至光照强度约为45 μmol/（m2·s）光照条件下培养2 周，获得再生芽。切下后，置于MS+0.4 mg/L NAA上诱导不定根，约3周获得再生植株。

1.2.2 香蕉遗传转化 将香蕉假茎薄片外植体置于活化后的农杆菌悬浮液中浸染30 min（其中先期漩涡震荡浸染20 min，而后静置10 min），转至共培养培养基（MS1=MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO3+100 μmol/L乙酰丁香酮AS+2 mg/L脯氨酸Pro）上。暗培养5 d后，转入筛选培养基（MS2=MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA+500 mg/L Carb+2 mg/L AgNO3+250 mg/L Km），继续暗培养。2周后，转入光下开始光培养（条件同再生体系），再经2周后，将抗性芽切下，置于MS+0.4 mg/L NAA+200 mg/L Carb+50 mg/L Km上生根，再过3 周，可获得完整抗性植株。

1.2.3 抗性植株的GUS、PCR、RT-PCR检测 利用上述再生体系和遗传转化体系，共得到15个抗性芽。经诱导获得7株抗性植株。经GUS染色法[17]检测，有5棵GUS阳性植株。用改良CTAB法[18]提取其叶片DNA，使用试剂盒（BioFlux）提取香蕉叶片RNA，并按照说明书进行PCR和RT-PCR扩增。PCR扩增参数为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性40 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共31个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检查。

1.2.4 转基因香蕉叶片叶绿素快速荧光与耐冷性测定

当香蕉幼苗长至三叶一心后，在25 ℃条件下，随机选取植株中部功能叶片，利用日本Konica Minolta公司的SPAD-502Plus型叶绿素仪测定叶绿素相对含量，每个处理重复测定6次，取其平均值。用美国Hansatech 公司生产的多功能植物效率仪（Multifunction Plant Efficiency Analysis，M-PEA）同时测定3 000 μmol/（m2·s）的红光照射下叶绿素荧光诱导曲线（OJIP）和820 nm光吸收曲线的变化。快速叶绿素荧光分析按照孙永平等[19]的方法进行。

另外，为了比较转基因植株的耐冷性，将野生型植株（WT）和2个转基因株系（T-1和T-2）转置于7 ℃、光照强度约为45 μmol/（m2·s）的光照培养箱中，经0.5、1.0、1.5 h后，用M-PEA检测低温胁迫后香蕉叶片叶绿素快速荧光特性，计算荧光参数，比较株系耐冷性。每个株系重复4次，取平均值。

1.3 数据处理

经方差分析和Duncan氏测验后，用EXCEL工具软件做图。

2 结果与分析

2.1 ‘巴西香蕉抗性植株获得及其PCR和RT-PCR检测

本研究利用已建立的香蕉再生与遗传转化体系获得了5株GUS+植株。提取叶片DNA，经PCR扩增，发现3株样品均可扩增出与阳性对照大小一致、分子量为1 804 bp的拟南芥HemA1启动子基因片段（图2-A），同时也能扩增出与阳性对照大小一致、分子量为246 bp的酿酒酵母菌Hem1基因（图2-B），说明含有YHem1的双元表达载体已经整合到香蕉基因组中（编号为1、2和3）。但是，提取叶片总RNA，反转录成cDNA，再检测目的基因YHem1时却发现，只有2号和3号植株可以扩增出250 bp片段（图2-C），说明YHem1基因只能在这2个株系中表达。

2.2 转基因香蕉株系ALA合酶活性和内源ALA含量

分析上述2个转基因株系叶片ALAS活性结果表明（表2），由于转入异源YHem1基因，ALAS活性在香蕉植株中可以被检测出来，其中T-2的酶活性略高于T-1，但两者未达到差异显著水平（p>0.05）。野生型植株（WT）不存在ALAS活性。比较不同基因型香蕉株系叶片内源ALA含量结果表明（表2），转基因株系均显著高于野生型，而转基因株系之间差异不显著。转基因株系内源ALA含量比野生型约高出11%。

2.3 不同株系香蕉叶片叶绿素相对含量的影响

由图3可以看出，转基因株系T-1和T-2的叶绿素相对含量（SPAD）明显高于野生型，增幅分别为14%和24%，且T-2含量显著高于T-1，表明转YHem1基因植物叶片能够积累更多叶绿素。

2.4 低温胁迫对香蕉叶片叶绿素快速荧光曲线的影响

从图4可知，常温下（图4-A）转基因香蕉与野生型叶片OJIP曲线存在一定差异，但整体变化趋势相近。即使在7 ℃低温胁迫0.5 h后（图4-B），仍然保持这种趋势。然而，当香蕉幼苗处于低温下1.0或1.5 h后，转基因植株仍然保持较高的荧光值（P相=Fm），而野生型植株则显著下降，特别是在1.5 h后（图4-D），这种差异更加明显，其中，T-1株系Fm比野生型高出8%，T-2株系比野生型高出19%，两者均达到p=0.05显著水平，说明转入YHem1基因可以显著提高香蕉植株PSII反应中心耐冷性。

2.5 低温胁迫对香蕉叶片PSII反应中心活性的影响

图5为低温胁迫1.5 h后2种基因型香蕉叶片PSII反应中心供体侧、受体侧电子传递活性以及能量转化效率相关的荧光参数。从图5可以看出，转基因植株Wk约为野生型的65%，极显著低于后者（p<0.01），表明低温胁迫降低野生型香蕉叶片PSII反应中心供体侧放氧复合体（OEC）活性，而转基因植株可以保持较高的OEC活性。但是，2基因型间PSⅡ最大光化学效率（φPo）却没有明显差异，甚至转基因植株φPo还略低于野生型，说明该项指标对低温胁迫相对稳定。φEo是PSII反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额。转基因植株φEo比野生型高出21%～43%（p<0.01），表明其PSII反应中心在低温胁迫下能够保持较高的能量转化能力。φDo是PSII反应中心以非光化学热能形式耗散的能量。从图5-A可以看出，转基因植株φDo只有野生型的77%～80%，显著低于后者，表明转入YHem1能够减少PSII反应中心以非光化学热能形式耗散的能量。J相相对可变荧光（Vj）和QA被还原的最大速率（Mo）反映的是PSII反应中心受体侧电子传递受阻情况。低温胁迫后转基因植株Vj和Mo分别为野生型的80%和60%，说明转入YHem1可以减少香蕉叶片PSII受体侧电子传递阻力，降低反应中心关闭速率。ψo为一个捕获的激子将电子传递到电子传递链中，QA下游其他电子受体的概率。转基因植株ψo比野生型植株高出17%～38%，表明它们经过低温胁迫后，仍然能够保持较高的电子传递能力。PIABS、PICS和PItotal分别为以吸收为基础的光合性能指数、单位面积光合性能指数和包括PSII和PSI在内的总的光合性能指数。T-1株系PIABS和PICS比野生型高出1倍，而PItotal比野生型高出47%；T-2株系PIABS和PICS比野生型高出1.8倍，而PItotal比野生型高出78%，说明转入YHem1基因极显著提高低温胁迫后香蕉叶片的光合性能。

从图5-B可以看出，转基因植株以单位反应中心计算出的吸收（ABS/RC）、捕获（TRo/RC）以及传递的能量（ETo/RC）只有野生型的62%～64%、65%～66%和86%～97%，但是，由于单位面积具有活性的反应中心密度（RC/CS）较野生型高出28%～37%（p<0.01），因而，以单位面积计算时，其传递的能量（ETo/CS）却比野生型高出18%～44%，说明低温胁迫降低香蕉叶片RC/CS，而转入YHem1基因可以维持叶片PSII反应中心密度，进而提高光能转化为化学能的能力。另一方面，转基因植株以热量形式耗散的能量DIo/CS和DIo/RC均显著低于野生型，说明低温胁迫下野生型植株通过非光化学形式耗散大量能量，而转基因植株能够将更多能量转化为化学能。

2.6 低温胁迫对香蕉叶片PSΙ在820 nm吸收曲线变化的影响

从图6-A可以看出，25 ℃常温下，不同基因型香蕉叶片MR/MRo最低点均在照光后10 ms。此时，PSΙ反应中心失去电子与得到电子正好达到平衡。但是株系T-2的相对数值比野生型以及株系T-1低得多，暗示着该株系PSI反应中心可以向下游输送更多电子。7 ℃低温处理1.5 h，3种基因型MR/MRo最低值出现在照光后7 ms，表明低温胁迫导致PSI反应中心氧化还原平衡点提早出现。此时，野生型MR/MRo显著上升，而T-2保持较低值，T-1显著下降，且与T-2间没有差异（图6-B），暗示着低温胁迫下野生型植株PSI反应中心可以向下游传递的电子数量减少，而转基因植株能够保持较高的电子容量。当t=0.7 ms时，3种基因型香蕉MR/MRo均为1；当t=7 ms时，MR/MRo分别为0.997 126、0.994 865和0.994 869。如果把0.7 ms与7 ms之间的MR/MRo差值看作PSI可以被氧化的电子容量，则2个转基因型株系可以被氧化的电子容量比野生型高出79%。

从图5-C可以看出，常温条件下不同基因型香蕉PSI反应中心氧化速率（Vox）没有明显差异（p>0.05），但是株系T-1的还原速率（Vred）比野生型高出68% （p<0.01）。株系T-2还原速率也略高于野生型，只是差异未达到显著水平。低温胁迫后，野生型PSI反应中心Vox没有明显变化，但株系T-2比野生型高出22%（p<0.05），暗示着T-2株系PSI反应中心向下游传递电子的速率高于野生型。从还原速率上看，2个转基因植株均高于野生型，其中T-2比野生型高出89%（p<0.01），说明转入YHem1基因可以显著提高香蕉叶片PSI反应中心附近电子传递速率，加速P700的氧化还原，防止光合光抑制。尤其是在低温胁迫下，这种促进效应更加明显。

3 讨论与结论

香蕉转基因研究已经有许多报道，所转化的基因主要与抗病性或果实成熟衰老有关[19]。能够提高香蕉耐冷性的基因工程迄今未见有报道。YHem1是一个人工构建的由拟南芥HemA1启动子控制的酿酒酵母菌Hem1基因。前人利用LBA 4404菌株将它转入烟草[11-12，14]、拟南芥[12-13]、草莓[15]等植物，可以诱导内源ALA过量合成，并且提高植物叶片光合能力和抗逆性。本试验首次利用浸染力较强的EHA105菌株，将YHem1基因转入香蕉假茎薄片组织，通过优化再生体系和遗传转化体系，获得15个抗性芽，其中5株GUS+。虽然在3株转基因株系的DNA中检测到YHem1基因，但是只有2株能够转录表达（图2-C）。这与以前报道略有不同。前人报道的转YHem1基因烟草[11-12，14]、拟南芥[12-13]和草莓[15]等，只要PCR能够扩增出启动子序列和Hem1基因，就能检测出RT-PCR产物。但在香蕉中，即使能够检测异源序列，也未必检测出mRNA，暗示着香蕉遗传转化可能存在更多假阳性。

前人研究结果表明，转入YHem1基因可以使得转基因植株具有ALAS活性[11]。这种酶并不存在于高等植物体内[8]，但是它所催化的底物包括琥珀酰CoA和甘氨酸却广泛存在于植物体内，因而只要YHem1基因能够转录为mRNA而后翻译成ALAS，便能诱导内源ALA过量合成。从本研究结果看，转基因植株内源ALA含量比野生型高出11%（表2），达到差异显著水平（p<0.05）。另外，由于ALA含量增加，导致转基因香蕉叶片叶绿素含量显著上升（图3），这与外源ALA处理香蕉植株的结果相似[5-6]。

转入YHem1的烟草[12，14]和草莓[15]叶片具有更强的光合能力，转入YHem1基因的拟南芥具有更强的耐盐性[12-13]。本文结果表明，在常温下转YHem1基因香蕉叶片叶绿素快速荧光特性与野生型没有显著差异，但在低温胁迫后，不同基因型叶片OJIP曲线呈现显著差异，而且这种差异随着低温时间延长而加剧。在7 ℃下处理1.5 h，野生型叶片Fm显著下降，而转基因植株保持较高水平（图4-D），证明转入YHem1基因可以提高香蕉植株耐冷性。实际上，不同基因型株系放置于南京地区普通玻璃温室中越冬后植株生长量出现极显著差异（图7），充分证明转入YHem1基因可以提高香蕉植株越冬能力。

分析PSII反应中心供体侧放氧复合体OEC活性受抑程度（Wk）发现，低温胁迫导致香蕉Wk显著上升，而转基因植株Wk仅为野生型的65%（图5-A）。这与外源ALA处理低温胁迫下的西瓜相似[20]，但是，效果却比外源处理好得多，因为后者只观察到变化趋势，却未达到差异显著水平。这可能是物种间差异，也可能是内源ALA合成增加与外源ALA处理的差异。相反，外源ALA处理导致西瓜叶片PSII反应中心最大光化学效率（φPo）显著上升[20]，但转基因香蕉φPo在常温或低温条件下均未出现明显变化（图5-A），说明φPo不是低温胁迫下香蕉植株的敏感指标。其它荧光参数，如Vj和Mo在低温胁迫后上升，在转YHem1基因中保持较低水平；ψo、φEo、PIABS、PICS、PItotal、RC/CS和ETo/CS在低温胁迫后下降，在转YHem1基因中保持较高水平（图5）。这些结果与外源ALA处理[20]或者转YHem1烟草[12]、草莓[15]相似。据此看来，本研究将YHem1基因转入香蕉，促进内源ALA合成，可以保护低温胁迫下香蕉叶片PSII反应中心供体侧和受体侧的光合电子传递，降低关闭速率，减少热耗散能量，提高低温胁迫下的叶片光合性能。

目前对转YHem1基因植株PSI反应中心的研究比较少，但是，低温导致的光抑制更重要的在于PSI反应中心[19]。从以往研究结果看，外源ALA处理植株OJIP曲线的I相和P相显著高于对照，暗示着QA以远电子受体接受电子能力增强[20]。本研究首次利用M-PEA研究转基因香蕉PSI反应中心活性。从获得结果看，低温胁迫降低了香蕉叶片PSI反应中心被氧化的速率和容量，同时也降低了还原速率（图6）。也就是说，低温后照光，PSI反应中心电子不能及时或者只有部分电子可以传递到下游电子受体（如NADP+）上，而来自于PSII或其它电子供体的电子不能及时供给PSI，因而，PSI活性下降。这是低温诱导光抑制的典型症状[21]。曾推测[22]，外源ALA处理通过提高PSI附近SOD等抗氧化酶活性来消除活性氧及其电子能量。这可以提高PSI反应中心氧化速度。转基因香蕉叶片PSI反应中心还原速率提高的原因有2种可能性。一是与PSII活性上升有关（图4），导致更多电子从水光解传递给PSI，二是在PSI周围存在环式电子通路，如铁氧还蛋白（Fd），它不把电子传递给NADP+而是回传给细胞色素bf复合体和质体醌[21]，从而增加PSI反应中心电子循环，促进光合磷酸化生成ATP。在拟南芥上，笔者曾观察到转YHem1基因植株Fd基因表达量比野生型高出2.3倍（汪良驹等，未发表）。因而，转YHem1香蕉在低温胁迫下之所以具有更高的光合能力，不仅与PSII活性上升有关，也与PSI活性上升有关。但ALA提高植物PSI反应中心的具体情况还有待于进一步证实。

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