陈晶晶等

摘 要 应用RACE方法克隆得到番荔枝CO同源基因cDNA的全长，命名为AsCO（基因登录号：KJ699387）。AsCO基因开放阅读框1 083 bp，编码360个氨基酸，推测蛋白质分子量为39.65 ku，等电点为4.72。序列分析结果显示：AsCO基因编码的蛋白氨基端具有2个典型的B-box 型锌指结构域，碳端具有CCT结构域，属于第一类CO基因。同源性分析结果表明，AsCO蛋白与北美木兰CO蛋白亲缘关系最近，与其它植物的亲缘关系较远。定量 RT-PCR分析结果表明，AsCO基因在去除叶柄的花芽中表达量比不去叶柄的表达量高，在花蕾发育的不同阶段呈现先上升再下降的趋势。

关键词 番荔枝；CO基因；序列分析；表达模式

中图分类号 Q949.747.3 文献标识码 A

Abstract A full-length cDNA sequence of homologous CO gene was cloned by employing RACE from cherimoya， which was named as AsCO（GenBank accession No. KJ699387）. The AsCO gene open reading frame（ORF）is 1 083 bp in length，encoding a protein of 360 amino acids，with an estimated molecular weight and an isoelectric point of 39.65 ku and 4.72 respectively. The bioinformatics characterization indicated that the protein encoded by AsCO gene has two typical B-box type zinc finger domain structure in amino terminal， and CCT domain structure in carbon terminal，which belongs to the first kind of CO gene. A comparison of the homologous amino acid sequences from different species indicated that AsCO protein has the closest relative with Magnolia virginiana CO protein， relationships with other plant is far. Expression analysis by qRT-PCR indicted that in the flower bud of removing petioles， the AsCO gene expression was higher than that of which keeping petioles，and in the different stages of flower buds development，gene expression presents firstly increasing and then reducing.

Key words Cherimoya；CO gene；Sequence analysis；Expression pattern

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.013

African Pride（以下简称AP）番荔枝（Annona squamosal L.）是从阿蒂莫耶番荔枝杂交种（Annona atemoya Hort.）中选出的一个优良热带果树，是目前世界热带及亚热带地区最受欢迎的番荔枝之一。番荔枝的芽为复芽，腋芽被叶柄抱嵌，若叶柄不脱落，腋芽一般不会萌发。在生长季节，主要靠人工将老熟枝条上任一节位的叶片和叶柄摘除，并结合剪顶使腋芽抽发新梢，有80%以上的新梢能够成花[1]。这种催花方式需要对每个成熟枝条进行处理，才能诱导枝条成花，这种方式费工费时，且如果对该技术掌握不到位，会影响番荔枝的产期调节和果实质量。对于番荔枝这种独特的成花机制，国内外少有深入的研究，目前关于开花相关基因在此过程中发挥的作用还不清楚。

CO（CONSTANS）是调控植物开花早晚和光周期调控途径中的一个重要基因[2-3]，位于生物钟的输出途径，是生物钟和开花时间基因之间监测日照长度的重要元件，可进行光信号和生物钟信号的整合，并激活下游基因FT的表达从而诱导植物开花[4]，但在番荔枝成花过程CO基因在各器官的表达情况及作用机理的研究尚未见报道。CO基因首先在拟南芥中分离得到[5]，利用拟南芥的CO基因序列通过图位克隆和同源克隆的方法，目前已经在水稻[6]、牵牛花[7]、萝卜[8]、美洲黑杨[9]、小麦[10]、大麦[11]、多年生黑麦草[12]、马铃薯[13]、番茄[14]、豌豆[15]、葡萄[16]、高羊茅[3]、国兰[17]、烟草[18]、北美木兰等多个不同科（属）的物种中克隆得到CO同源基因。目前研究结果表明，拟南芥中CO基因家族共有17 个成员[19]，水稻中共有16个成员[11]，该家族基因可编码包含两个结构域的蛋白质，一个是靠近氨基端的锌指结构域，另一个是靠近碳端的CCT（CO、 CO-like、 TOC1）结构域[3]。根据靠近氨基端的锌指B-box结构的不同，可把CO基因家族分为3类：第1类基因有2个锌指 B-box；第2类基因只有1个锌指 B-box；第3类基因含有1个B-box和1个结构发生改变的锌指蛋白结构域[19]。研究结果表明，B-box类型锌指结构的GATA转录因子具有调节蛋白之间相互作用的功能[20]，CCT结构域则参与核定位和蛋白之间的相互作用[21]。基因在锌指结构域内发生突变后基因功能便会丧失，而基因在CCT结构域发生突变后只会使开花延迟[19]。

本研究以AP番荔枝为实验材料，基于NCBI上blast得到的CONSTANS基因序列设计的简并引物，利用3′RACE与5′RACE方法从AP番荔枝中分离出CONSTANS基因，并对其在番荔枝花芽和花蕾中的表达特性进行初步研究，为番荔枝开花途径分子机理的阐明和花期调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 AP番荔枝供试样品采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种植资源圃，每年3月进行修剪，选取3种处理方式下长出的花芽（正常：枝条不去顶，不去叶柄；处理1：枝条去顶，去除叶柄；处理2：枝条不去顶，去除叶柄）及处理1（生产上的方式）修剪后新长出不同发育阶段的花蕾作为实验材料。

1.1.2 试剂 RACE试剂盒（SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit，Clontech），pMD18-T克隆载体、RNA反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser），LA Taq、dNTPs、DL 2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；Dynamo Color Flash SYBR Green qPCR Kit（Thermo Fisher）购自广州赛哲生物公司；RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒、DH5α感受态大肠杆菌、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化（北京）有限公司。酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖、IPTG、X-Gal、氨苄青霉素等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA第一链的合成 参照RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒中的方法，提取AP番荔枝花芽和不同发育时期花蕾中的总RNA。采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit（用于基因克隆）和 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（用于定量PCR）反转录试剂盒，按照其说明书进行逆转录成第一链cDNA。

1.2.2 番荔枝CO同源基因全长的克隆 利用DNAMAN生物软件对已知植物CO同源基因进行同源比对分析，在其保守区设计简并上下游引物 CO-f和CO-r（表1）。PCR扩增番荔枝CO同源基因的模板为AP番荔枝花芽cDNA，总体系为25 μL（cDNA 1 μL；上下引物各1 μL；dNTPs 0.5 μL；ddH2O 18.80 μL；buffer 2.5 μL；LA Taq 0.2 μL）。扩增条件为：95 ℃预变性 4 min；95 ℃变性 40 s，53 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 2 min，35 个循环；72 ℃延伸7 min。最后PCR扩增产物回收，连接到T载体，送到测序公司进行测序。

根据得到的番荔枝CO同源基因序列，按照RACE试剂盒的要求，逆转录生成cDNA 第一链。分别设计5′RACE巢式引物CO-GSP1、CO-NGSP1 和3′RACE巢式引物CO-GSP2、CO-NGSP2（表1）。 第一轮反应程序为：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25个循环。8 μL PCR产物进行电泳检测，如无法检测到明显条带，即用第一轮PCR产物为模板，进行二次巢式扩增，扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。所有PCR扩增到条带后，均回收目的条带，并对目的条带进行凝胶回收、载体连接、转化、鉴定及测序。

1.2.3 番荔枝CO基因序列分析 在NCBI中利用Blast检索番荔枝CO同源基因的相似性；利用DNAStar软件寻找开放阅读框，预测相对分子量和等电点，利用DNAMAN软件进行序列拼接、氨基酸序列同源性分析、构建CO蛋白系统进化树；并通过ExPASy（http：//www. expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）进行蛋白质的疏水性分析；运用Target（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行亚细胞定位预测；应用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/ npsa_sopma.html）预测其编码蛋白的二级结构；利用NCBI的CDD（conserved protein domain database）进行蛋白质保守结构域进行分析。

1.2.4 番荔枝CO同源基因在花芽和花蕾中的表达分析 采用SYBR Green Ⅰ染料法，利用定量RT-PCR 探讨番荔枝CO基因在花芽和花蕾的不同发育时期的表达情况。根据获得的番荔枝CO基因的全长序列，在其不保守区域设计定量引物qCO-F与qCO-R，扩增片段大小为158 bp（表1）。根据前期工作克隆得到的番荔枝管家基因AsActin设计1对内参定量引物qActin-F和qActin-R，扩增片段大小为189 bp（表1）。定量RT-PCR反应体系为：2×DyNAmo color Flash SYBR Green master mix 10 μL、模板cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.6 μL，ddH2O补至20 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s（real time 荧光采集），40个循环；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃（荧光采集结束），40 ℃ 30 s（冷却）。每个样品在同一板中重复3次。

2 结果与分析

2.1 番荔枝CO同源基因全长的克隆

提取的番荔枝各组织RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S、18S条带明亮清楚，基本无DNA条带（图1-A）。紫外分光显示：A260/280值为1.93左右，A260/230值为2.25左右。这表明提取的番荔枝RNA基本无降解及污染，可满足后续工作的需要。

以番荔枝花芽提取的总RNA为模板，利用简并引物CO-f和CO-r进行RT-PCR扩增，获得1条700 bp 左右大小条带（图1-B），测序后在NCBI上Blast检索发现，该序列与CO基因具有很高的同源性，确定该扩增片段为番荔枝CO基因的编码序列。利用5′RACE引物CO-GSP1、CO-NGSP1 和3′RACE引物CO-GSP2、CO-NGSP2，与RACE 试剂盒中的引物相结合进行套式PCR，克隆其5′端与3′端。经过5′RACE和3′RACE分别获得了大小为508、916 bp的PCR产物（图1-C、D），克隆测序后发现，5′端和3′端序列与已知序列有重叠，为番荔枝CO基因mRNA的5′端和3′端序列。3个序列经DNAMAN软件拼接后得到番荔枝CO基因完整cDNA序列，去除polyA后，全长1 557 bp，然后利用全长引物qcCO-f和qcCO-r，扩增到长约1 355 bp的片段（图1-E），测序结果与拼接序列一致，命名为AsCO，提交GenBank，获得登录号为KJ699387。

2.2 番荔枝CO基因编码蛋白分析

经DNAStar生物软件分析AsCO基因cDNA的全序列，其中发现1个完整的开放阅读框，起始密码子在26位，终止密码子在1 109位，其开放阅读框为1 083 bp，推测编码360个氨基酸，预测蛋白质的等电点为4.72，相对分子质量为 39.65 ku。

疏水性分析：一方面可为二级结构预测结果提供参考，另一方面可为结构域及功能域的划分提供依据。利用ExPASy的ProtScale软件对AsCO蛋白进行水性分析，结果显示AsCO蛋白C端偏向疏水性，N端疏水性明显，位于分子内部；中间部分亲水性与疏水性交替出现，但总体来说该蛋白亲水性更强。疏水性最大值为 1.567，最小值为-3.589，达-2以下的亲水峰有8处（图2）。

应用SOPMA预测AsCO蛋白的二级结构，结果发现，AsCO蛋白含有约25.83%的α-螺旋、11.11%的延伸链、2.5%的β-转角和60.56%的不规则卷曲（图3）。

运用软件TargetP和SignalP预测AsCO蛋白的亚细胞定位，发现AsCO蛋白在线粒体、叶绿体上没有信号肽，因此AsCO可能存在于细胞质中。

2.3 AsCO蛋白保守结构域分析

应用NCBI中的CDD程序对其行氨基酸保守结构域进行分析，结果发现 AsCO蛋白N端含有2个B-box 型锌指结构域，分别在13～57和56～100的位置，C端含有45个氨基酸的CCT结构域，在56～337位置。B-box锌指构型为CX2 CX8 CX7 CX2 CX4 HX 8H（X为任意氨基酸），与拟南芥CO蛋白构型相似[5]，属于CO基因家族的第一类。B-box和CCT结构域中含有CO功能必不可少的氨基酸残基，同时CCT结构域中还含有核定位信号。与其他25种植物中已经克隆的同源基因编码蛋白的氨基酸序列进行比对，结果表明：在N端的锌指结构中，第1个B-box完全保守，第2个B-box的保守性较低（图4），如禾本科植物中的大麦、高羊茅、黑麦草中的第一、第三和第五个半胱氨酸被其他氨基酸代替，而在CO基因编码蛋白的C端有保守的核定位区域（图5），该区域在进化过程中非常保守。综上所述，锌指结构区域的保守性低于核定位信号区域。

2.4 番荔枝CO基因在花芽和花蕾中表达模式分析

通过分析CO基因在3种不同处理方式下分化的花芽中的表达量（图6），处理1花芽和处理2花芽中CO的表达量均明显高于正常花芽中的表达量，分别是正常花芽表达量的1.67、1.72倍。而CO基因在花蕾发育的不同阶段，总体上呈现先上升再下降的趋势，在花蕾发育阶段中的花蕾3表达量最高，当花蕾快要开裂时，表达量降到最低，说明CO基因对开花过程的调控呈现动态变化。处理1和处理2花芽中CO的表达量均比花蕾中各发育时期的高，推测在花芽分化期更需要CO基因的表达。

3 讨论与结论

本研究以NCBI 上公布的CO同源基因为基础，设计了1对在CO基因保守区扩增的简并引物，再根据得到的番荔枝CO基因片段，利用5′RACE和3′RACE手段获得了番荔枝CO基因的全长序列，在NCBI上进行保守结构域分析，结果发现番荔枝CO基因具有CO基因典型的2个B-box 类型锌指结构和CCT结构域，属于CO基因分类的第一类，命名此基因为AsCO，并在GenBank申请登录号为KJ699387。

本研究从番荔枝中克隆到光周期途径的关键基因CO，目前对番荔枝开花相关基因的研究较少，在NCBI上也仅发现同属木兰目的北美木兰CO基因被克隆，同源比较结果发现，其同源性有75%，而与其他不同科、属植物的CO基因的同源性都较低。从构建的系统进化树可以看出，CO基因不仅在裸子植物和被子植物间存在分化，而且在单子叶植物和双子叶植物及不同的科、属植物中也存在分化。由此可见，在植物的进化过程中，CO基因在不断地发生变化与分歧。

成花转变过程由植物自身遗传因子和外界环境因素两方面共同决定，并受错综复杂的网络信号传导途径调控[22]。番荔枝侧芽被叶柄基部紧紧包裹，叶片不脱落，新芽就不能萌发，但通过短截去叶等技术措施，却能在去叶的节位萌发新梢并开花结果，在番荔枝成花转变过程中，开花调控基因CO的作用如何，对其在花芽和花蕾中的表达进行了初步研究。通过比较不同处理手段对CO基因表达量的影响发现，去掉叶柄后，处理1花芽和处理2花芽的表达量均比不去叶柄的处理高，说明只有去掉叶柄，侧芽暴露出来，开花基因CO才开始大量表达，其原因可能是侧芽暴露出来，才能感受到光照信号，促进开花相关基因的表达。CO基因能引起花分生组织基因的表达，作用机理是将来自于光周期途径中的信号传递到FLOWERING LOCUS T（FT）和 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSIONOF CO1（SOC1）等成花信号枢纽处来促进开花[23]。而处理1和处理2的区别在于形成花芽数量的多少，处理1是番荔枝生产上的处理方式，去掉枝条顶端能促进更多的侧芽形成花芽。研究结果还发现在花蕾发育的不同阶段，CO基因的表达也呈现不同的变化趋势，当处于花蕾发育中期时（花蕾3），表达量达到最大，当花蕾快要开裂时（花蕾5）表达量最低，说明CO在花蕾发育的不同阶段通过不断调整其表达量来发挥其调控作用的。在不同的植物当中，CO基因的作用并不完全一样，如番茄中的SlCO2基因与调控开花时间无关，但其在拟南芥中过量表达可使拟南芥花期延迟，而牵牛花的PnCO基因则可以弥补拟南芥co突变体的晚花表型并使其比野生型拟南芥开花期提前[24]，在番荔枝中仅初步分析了其在不同处理下花芽和花蕾不同发育阶段的表达情况，对于其在番荔枝成花调控中的具体机制还需要进一步研究。CO在植物进化中相对保守，各个物种中的CO基因都包含有1个保守的锌指结构域和1个CCT结构域，但不同植物的CO同源基因的拷贝数有所不同，各个拷贝发挥的功能也不一致，因此有必要对每一物种的各个CO同源基因进行表达和功能验证。现有的研究在CO同源基因编码区结构和功能方面已取得了一定的进展，这为利用基因工程进行植物的花期改良工作奠定了良好的基础，而在番荔枝上阐明其独特的成花机理，以及如何利用控制CO基因表达、促进叶片脱落、使得新芽萌发、实现不通过短截去叶等技术措施就能萌发新梢并开花结果，为番荔枝的生产应用提供了新的思路，这也是今后的研究方向。

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