李青青+王旭歌+钟甲丽+李旺

摘要： 根据GenBank已报道的枯草芽孢杆菌的基因序列，设计特异性引物，经PCR分别从B.subtilis L、B.subtilis K基因组中扩增得到3个纤维素酶基因序列，基因片段分别长约700、1 500、1 700 bp。连接到T载体上进行测序，获得该3个纤维素酶基因片段的DNA序列，在线比对分析表明3个基因的部分碱基序列与已报道的纤维素酶基因的序列同源性达99%。这3个基因的全序列在GenBank中未见报道，且通过软件对比，三者没有任何相似性。根据3个纤维素酶基因的来源分别命名为Lcen、Ken、Kkg。借助软件分析确定Lcen基因全长699 bp，基因序列为1个完整的阅读框，连续编码232个氨基酸。Ken基因全长1 500 bp，连续编码499个氨基酸。Kkg基因全长1 686 bp，基因序列为1个完整的阅读框，连续编码561个氨基酸。3个基因均属于纤维素酶家族大类。

关键词： 纤维素酶；基因；克隆；序列分析

中图分类号： Q785 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0040-04

纤维素是地球上最丰富的可再生自然资源[1]。全球每年纤维素产量达2 000亿 t[2]，仅我国秸秆产量就达5亿～7亿t，大部分被焚烧、丢弃，不仅浪费资源，而且会对环境造成污染[3]。纤维素是一种无色、无味的白色丝状物，难溶于一般的有机溶剂及水，是植物细胞壁的主要组成部分。植物纤维素结构基本由结晶区域、无定型区域组成，纤维素结晶区域比无定型区域难降解[4]。酶解法是目前降解纤维素最有效的方法[5]。纤维素酶是能够分解纤维素、最终将其降解成葡萄糖的一类酶的总称。根据纤维素酶催化反应功能的不同可将其分为：（1）内切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键；（2）外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4糖苷键；（3）β-葡萄糖苷酶，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子[6]。纤维素酶分子多数由球状的催化结构域（catalytic domains，CD）、连接桥（linker）、纤维素结合结构域（cellulose-binding domains，CBD）3个部分构成[7-9]。纤维素酶分布广泛，目前饲料用纤维素酶主要从微生物中获得。随着分子生物学、基因工程技术的发展，对纤维素酶分子层面研究也随之展开，纤维素酶基因的克隆与表达成了研究焦点。细菌、真菌的纤维素酶系不断被人们发现、分离，大量纤维素酶基因得到克隆、表达，丰富了纤维素酶的研究材料[10]。结构功能完整的纤维素酶基因克隆到高效表达载体上再进行异源表达，能使纤维素酶的产量成倍提高[11]。本试验对纤维素酶系内的3个纤维素酶基因进行克隆和序列分析，旨在为后续高效联合表达纤维素酶系基因进行研究准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 Bacillus subtilis K、Bacillus subtilis L均由实验室筛选并保存，大肠杆菌DH5α购于北京天根生化科技有限公司，pGEM-T Easy Vector System购于Promega公司。

1.1.2 主要试剂 DL 2000 Marker、溴酚蓝、琼脂糖购自北京天根生化科技有限公司；Taq酶、DNTP、各种限制性内切酶购自Promega公司；溴化乙锭（EB）、抗生素（Amp）购于北京索莱宝科技有限公司；RNA酶，蛋白酶K购于北京中科瑞泰生物科技有限公司；琼脂粉、蛋白胨购于Oxid公司。基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂盒均购自于中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

1.1.3 引物 试验中的3对引物序列：

ENF： 5′-ATGAAACGGTCAATCTCTATT-3′；

ENR： 5′-CTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3′；

CENF：5′-ATGAAAAAGATCATGAGTGCAT-3′；

CENR：5′-TTATTCAGGAAACTGAACATGG-3′；

KGF：5′-ATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG-3′；

KGR：5′-TCATATACTAATGCCCATCACAG-3′。

1.2 方法

LB培养基的配制：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，固体LB培养基加入20 g琼脂粉，120 ℃高压灭菌30 min。细菌基因组DNA的提取、质粒DNA的提取、DNA的凝胶回收参照试剂盒提供的说明进行。纤维素酶基因的PCR扩增、纤维素酶基因片段与T载体的连接、重组质粒导入感受态细胞、含纤维素酶基因的重组质粒的酶切鉴定参照《分子克隆试验指南》规定的方法进行。纤维素酶系基因的序列测定由北京擎科新业公司完成。用VectorNT软件和NCBI Blast 2.0在线软件对该纤维素酶基因的序列进行分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶基因的克隆

根据GenBank公布的纤维素酶系的内切葡聚糖酶基因、外切葡聚糖酶基因、葡萄糖苷酶基因序列设计特异性引物：ENF（R）、CENF（R）、KGF（R），以提取得到的B.subtilis K、B. subtilis L基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增结果如图1所示。扩增得到的DNA片段大小分别为1 500、700、1 700 bp左右。根据来源不同分别将3个基因命名为Ken、Lcen、Kkg。

2.2 纤维素酶基因的鉴定

分别将片段回收，连接于T载体上转化到大肠杆菌培养，挑取单菌落，进行重组质粒PCR鉴定（图2-A），凝胶上有明显的DNA条带，与PCR扩增的结果一样。进行酶切鉴定（图2-B），凝胶上分别出现2条明显的DNA条带，一条大小约为3 kb与T-easy载体的片段大小一致，另一条带大小分别约为1 500、700、1 700 bp，与PCR扩增的结果一致。由此确定PCR扩增产物顺利连接到T-easy载体上，构建了3个基因与T-easy连接的重组质粒，分别命名为LcenT、KenT、KkgT。

2.3 纤维素酶基因的序列分析

将3个纤维素酶基因重组质粒LcenT、KenT、KkgT分别进行测序，并通过VectorNT软件和GenBank数据库对3个基因的序列进行分析。

2.3.1 Lcen基因的序列分析 对LcenT重组质粒进行测序，得到的基因序列如图3所示。

用VectorNT软件对Lcen基因序列进行分析发现，该基因全长699个碱基，组成1个完整的开放阅读框（open read frame，ORF），连续编码232个氨基酸，起始密码ATG，终止密码TAA。

利用NCBI网站上的Blast功能对该基因序列进行比对发现，基因Lcen与已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因GU327817.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1十分相似，相似度为99%。对其编码的氨基酸进行比对分析发现，该基因编码的氨基酸序列与已报道的枯草芽孢杆菌胞外的葡萄糖苷酶基因NP389744.1、YP007427045.1、YP004203797.1、YP006231826.1、ZP06873100.1的氨基酸序列十分相似，相似度达到95%。故可初步确定该基因来源于枯草芽孢杆菌，属于纤维素酶基因。

对基因编码的氨基酸序列进行分析和预测得知，该基因编码的氨基酸结构属于罕见的脂蛋白（RlpA）超家族，基因序列部分与罕见的脂蛋白、假定的EG45-like域包含蛋白1、内切葡聚糖酶c终端域/亚单位和相关蛋白质相似性高。

2.3.2 Ken基因的序列分析 对KenT重组质粒进行测序，得到的基因序列如图4所示。

用VectorNT软件对Ken基因序列分析，KenT的基因全长1 500个碱基，组成1个完整的开放阅读框，连续编码499个氨基酸。起始密码ATG，终止密码TAG。利用NCBI网站上的Blast功能对该基因序列进行比对发现，基因Ken的序列与已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因FJ800366.1、EF070194.1、KC477685.1、CP002468.1、HM543165.1基因序列十分相似，相似度为99%。对其编码的氨基酸进行比对，该基因编码的氨基酸序列与已报道的枯草芽孢杆菌的内切葡萄糖苷酶基因NP389695.2、AFX88666.1、YP007209477.1、ACK38261.1的氨基酸序列十分相似，相似度达到99%。故可确定该基因来源于枯草芽孢杆菌，属于纤维素酶基因。

对该基因编码的氨基酸结构进行分析预测发现，该基因编码的氨基酸属于水解酶超级家族，整体由2个主要部分组成（图5），一部分为纤维素酶区域（cellulase，图5-A），一部分为纤维素酶的绑定区域（CBM-3，图5-B），其中的纤维素酶区域结构符合糖基水解酶家族5的结构特征。

2.3.3 Kkg基因的序列分析 对KkgT重组质粒进行测序，得到的基因序列如图6所示。

用VectorNT软件对Kkg基因序列分析，Kkg基因全长1 686个碱基，组成1个完整的开放阅读框，连续编码561个氨基酸。起始密码ATG，终止密码TGA。

利用NCBI网站上的Blast功能对该基因序列进行比对发现，Kkg的基因序列与已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因cp002468.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1序列十分相似，相似度为99%。对其编码的氨基酸进行比对分析发现，该基因编码的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因YP004205293.1、YP007208039.1、YP007428400.1、YP007664110.1、ZP12669813.1的氨基酸序列十分相似，相似度达到99%。故可初步确定该基因来源于枯草芽孢杆菌，属于纤维素酶基因的类别。对该基因编码的氨基酸结构进行分析和预测发现，该基因编码的氨基酸属于 α-淀粉酶的超家族，基因编码的氨基酸序列上包含纤维素酶活性部位、Ca绑定结构域、催化部位（图7）。

3 结论与讨论

纤维素酶的应用非常广泛，然而天然纤维素酶由于酶活较低以及成本高等因素的限制，对于大规模的工业化应用有一定困难。近年来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，对纤维素酶分子层面的研究也随之展开，纤维素酶基因的克隆与表达成了研究焦点。 目前常用的基因克隆方法有人工合成法、PCR扩增法以及构建基因文库等[12]。本试验通过GenBank检索枯草芽孢杆菌纤维素酶基因，根据基因的编码序列设计3对引物，从B. subtilis K、B. subtilis L基因组DNA扩增出了3个基因片段，通过测序得到基因序列。枯草芽孢杆菌是目前细菌纤维素酶基因的主要来源，已报道的大部分纤维素酶基因均从枯草芽孢杆菌中获得[13-14]。已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因大多数属于内切葡聚糖酶（endo β-1，4 glucanase）基因[14]。在纤维素酶基因克隆上，不论是从何种微生物上进行克隆，大部分报道均是克隆获得1个基因。本试验同时从Bucillus subitilis K基因组DNA中克隆得到2个纤维素酶基因Ken、Kkg，其中Ken大小为 1 500 bp，与已报道的大多数枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因一致，属于纤维素水解酶家族；Kkg基因全长1 686 bp，与已报道的枯草芽孢杆菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因一致，在结构分析上，该基因属于α-淀粉酶的超家族。

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