王振斌 王 玺 马海乐 林晓明 王 林 王 干 白志杰

（江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013）

芝麻饼粕蛋白质是一种营养价值较高的完全蛋白质资源。蛋白质的功能性质与蛋白质分子质量大小、结构特征、氨基酸组成、带电情况等理化性质直接相关［1-4］，还与加工条件及pH、温度、离子强度等外部环境等因素密切相关［1-2］。充分掌握蛋白质的功能特性，对于蛋白质在食品工业中的应用，以及进行新型蛋白质食品的开发具有重要意义。国内外对于芝麻蛋白质理化和功能性质的已有研究指出芝麻蛋白是食品工业潜在的原材料［5-7］。芝麻蛋白提取方法较多，其中碱溶酸沉法、超声辅助碱提法和蛋白酶法具有广阔的产业化前景。提取方法对蛋白质的物理和功能性质具有显著的影响，针对提取技术对芝麻蛋白理化和功能性质的对比研究目前鲜见报道。

本试验以碱溶酸沉法、超声辅助碱提法和蛋白酶法3种不同工艺制备的芝麻饼粕蛋白质产品为原料，对其理化性质和功能性质进行对比研究，以期为芝麻饼粕蛋白质的工业化提取技术的选择提供理论依据，并推动芝麻蛋白在食品工业上的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芝麻饼粕蛋白质：自制；芝麻饼粕：新沂吉顺昌油脂科技有限公司；标准蛋白质：美国Sigma公司；大豆色拉油：市售；分析纯试剂：氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，国药集团化学试剂公司。

pH5-3C型pH计：上海理达仪器厂；HH-A恒温水浴搅拌锅：江苏金坛市中大仪器厂；SPF401F电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）中国有限公司；TGL-16高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；FJ200-S数显高速分散均质机：上海标本模型厂；FD-1A-50冷冻干燥机：北京博医康试验仪器有限公司；FOSS 2100型凯氏定氮装置：上海新嘉电子有限公司；AKTA Purifier 100蛋白质分离纯化设备：美国 GE Healcare集团；Sykam S433D／S433氨基酸分析仪：上海仁特检测仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芝麻饼粕蛋白质的制备

在预备试验的基础上，确定碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质PA的工艺条件为：NaOH浓度0.37 mol／L，提取温度75.19℃，提取时间4.7 h，液料比25.19，提取次数1次，提取结束后离心过滤，所得上清液即为芝麻饼粕蛋白质提取液，以1mol／L盐酸调上清液pH至4.0（芝麻饼粕蛋白质等电点）使蛋白质沉淀，静止30 min后4 500 r／min离心20 min，弃上清，所得沉淀再加5倍体积70%乙醇，室温浸泡30 min，离心，再加2次2倍体积去离子水洗涤，离心，下层蛋白质真空冷冻干燥即得芝麻饼粕蛋白质产品，产品中蛋白含量为58.76%；超声辅助碱提法制备芝麻饼粕蛋白质PU的工艺条件为：超声功率密度2.22 W／mL，超声时间30 min，超声温度70℃，NaOH浓度0.33 mol／L，液料比50，提取结束后离心过滤，所得上清液即为芝麻蛋白质提取液，以1 mol／L盐酸调上清液pH至4.0（芝麻饼粕蛋白质等电点）使蛋白质沉淀，静止30 min后4 500 r／min离心20 min，弃上清，所得沉淀再加5倍体积70%乙醇，室温浸泡30 min，离心，再加2次2倍体积去离子水洗涤，离心，下层蛋白质真空冷冻干燥即得芝麻饼粕蛋白质产品，产品中蛋白含量为60.23%；蛋白酶法制备芝麻饼粕蛋白质PE的工艺条件为：酶解时间45 min，pH 9，酶解温度50℃，加酶量4 000 U／g，液料比20，反应过程中经常以1 mol／L NaOH调节反应体系pH值，反应结束后，100℃灭酶 15 min，冷却后4 500 r／min离心20 min，下层沉淀再加5倍体积去离子水搅拌10 min后离心，合并3次上清液，真空浓缩、冷冻干燥即得芝麻饼粕蛋白质产品，产品中蛋白质含量为67.89%。

1.2.2 氨基酸分析

精确称取一定量样品置于水解管中，加入6 mol／L的 HCI溶液，真空封口，在110℃下水解24 h，冷却后定容、过滤、蒸干，取滤液1 mL于小烧杯中，真空干燥后加入1 moL 0.02 mol／L HCL溶液，在空气中放置30 min后，采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的含量（色氨酸除外）。

1.2.3 相对分子量的测定

采用AKTA Purifier 100蛋白质分离纯化设备进行检测，凝胶柱类型及规格为Superose1 210／300 GL（10 mm×300 mm）预装柱，检测波长为UV 215 nm，洗脱液为50 mmol／L pH 7.0磷酸盐缓冲液（含0.15 mol／L NaCl），上样体积为 500μL，洗脱流速 0.5 mL／min。分子量标品为牛血清白蛋白质（分子质量MW 67 000 u）、细胞色素（MW 12 700 u）、钴胺酰胺（VB12，MW 1 355 u）、Gly-Gly-Tyr-Arg（MW 451.48 u）。以标准蛋白质的相对分子质量对数（lg-MW）为横坐标（X），洗脱时间为纵坐标（Y）作线性回归分析，得到线性回归方程Y＝-4.094X＋30.66，相关系数R2＝0.990 4。

1.2.4 溶解性的测定

参照 Klompong法［8］。准确称取0.20 g样品溶于20 mL水中，分别调节至相应pH，室温搅拌30 min，4 500 r／min离心20 min后取上清液，用半微量凯氏定氮法［9］分别测定上清液和未处理样品中的含氮量，氮溶解指数（Nitrigon Solmion Index，NSI）计算公式为：

1.2.5 持水性和持油性的测定

参照Khalid法［10］。称取0.50 g蛋白质样品置于10 mL的预先干燥并称好质量的离心管中，加入5 mL去离子水（大豆油），充分振荡、混匀后，置于40℃水浴中保温30 min，4 000 r／min离心30min，倾去上层未吸附的水（大豆油），称重，按照式（2）计算每克蛋白质样品的持水性（持油性）。

式中：W0为蛋白质样品的质量／g；W1为离心管加干燥样品的总质量／g；W2为离心后离心管加沉淀的总质量／g。

1.2.6 乳化性及乳化稳定性的测定

参照Klompong法［8］。称取一定量样品溶解于不同pH缓冲液中配成1.0%的蛋白质溶液，室温搅拌30 min后，加入5.0 mL大豆油，以10 000 r／min均质60 s，立即从底部吸取100μL乳浊液与10.0 mL 0.1%SDS溶液混匀，500 nm处测定光吸收值A0，此值即为乳化活性（EA）。10 min后重新从静置的乳浊液底部取样测定光吸收值At。乳化稳定性（ES）用乳化稳定指数（ESI）表示：

式中：At为10 min时刻的吸光值；A0为0时刻的吸光值；Δt为3次测定乳化活性的时间间隔，本试验中该值为10 min。令 K＝At／A0，则当 ΔT为定值时，K与ESI成正比关系。为了避免计算时出现ΔA为0或负值，引进吸光值比（K）来描述乳化稳定性。

1.2.7 起泡性及起泡稳定性的测定

参照Rhicha法［11］。称取一定量样品溶解于pH 7缓冲液中配成1.0%的蛋白质溶液，室温搅拌30 min后，然后用数显高速分散机以10 000 r／min搅打60 s，立即全部转移至 50 mL量筒内，测定此时（0 min）泡沫的体积（V1）并代表起泡性FC。

读取室温静止放置30 min后量筒中泡沫体积（V2），则起泡稳定性FS计算公式为：

1.3 数据处理

采用SPSS软件分析，试验结果用“平均值±标准偏差”表示。P＜0.05为差异显著水平，P＜0.01为差异极显著水平。

2 结果与分析

2.1 芝麻饼粕蛋白质的氨基酸组成分析

碱溶酸沉法、超声辅助碱提法和蛋白酶法3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质PA、PU和PE的氨基酸组成及必需氨基酸含量见表1。从表1可以看出，3种工艺制备的蛋白质氨基酸组成平衡，必需氨基酸含量丰富，谷氨酸、精氨酸和天门冬氨等非必需氨基酸含量均相对较高，而赖氨酸含量相对较少，这可能是因为芝麻饼粕在工业制油过程中，由于物理或化学操作所造成的。3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质的氨基酸组成存在一定差异，但差异较小，导致差异的原因可能与制备的方法不同有关。由表2数据还可以看出，从亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例来看，3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质均是亲水性蛋白质，可以根据它们的氨基酸含量来判断其功能性质。与FAO／WHO理想必需氨基酸模式相比3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质中除赖氨酸含量稍低外，其他必需氨基酸组成均接近或高于FAO／WHO模式，所以3种工艺制备的蛋白质均具有良好的营养价值。由于蛋白质的营养价值主要是由氨基酸尤其是必需氨基酸的含量和比例决定的，所以，3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质营养价值高，适宜于进一步加工制作食用蛋白质以作为营养食品或加工食品的配料，从而提高其应用价值［12-15］。

表1 3种芝麻饼粕蛋白质的氨基酸组成分析／g／100 g

2.2 芝麻饼粕蛋白质的相对分子质量分布

碱溶酸沉法、超声辅助碱提法和蛋白酶法3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质PA、PU和PE的相对分子质量分布的吸收峰对应的相对分子质量与面积比如表2所示。表2可知，PA各组分相对分子质量5 000以上的芝麻饼粕蛋白质占总量的78.74%。PU各组分相对分子质量5 000以上的芝麻饼粕蛋白质占总量的74.87%。PA与PU的吸收峰的相对分子质量和分子量分布范围百分比都比较接近，说明短时间的超声波在加速蛋白质溶出的同时对蛋白质分子结构的破坏力比较小。PE各组分相对分子质量2 000以下的芝麻饼粕蛋白质占总量的73.8%。与PA及PU相比，PE中低分子质量肽链所占的比重较大。这是因为蛋白酶在一定的条件下对芝麻饼粕蛋白质长链的水解作用。

表2 3种芝麻饼粕蛋白质产品相对分子量分布比例

2.3 芝麻饼粕蛋白质的溶解性的比较

由图1可知，在不同的pH值下，芝麻饼粕蛋白质溶解性不同，在等电点附近（pH 4）时NSI最低，溶解性差，而在偏离等电点的酸性和碱性条件下NSI较高。因为芝麻饼粕蛋白质分子是两性分子，既能像酸一样解离，又能像碱一样解离。在酸性介质中，蛋白质分子主要以正离子状态存在，电荷互相排斥，分子分散性好，溶解性较好。但是随着pH值的升高，芝麻饼粕蛋白质的NSI就逐步下降，在等电点附近时，蛋白质以两性离子状态存在，NSI变得最低，当pH值继续升高，蛋白质又变成负离子，NSI随着pH值得升高而升高［12］。

图1 pH对3种芝麻饼粕蛋白质的溶解性的影响

由图1可知，在相同pH条件下3种方法制备的芝麻饼粕蛋白质的氮溶解指数存在明显差异，特别是在酸性条件下。在等电点时，碱溶酸沉法、超声辅助碱提法和蛋白酶法制备的芝麻饼饼粕蛋白质的NSI分别为7%、40.23%和72.5%，三者差异极显著。总体上：PE＞PU＞PA。超声波辅助碱提可以提高蛋白质的溶解性，原因可能是超声波处理使蛋白质结构疏松，亲水性增强，同时超声波处理能打断蛋白质分子表面的自由氨基群与邻近的羧基群之间的静电引力，使蛋白质分子彼此分散，不易聚集，因而提高了蛋白质的溶解度［13-14］。蛋白酶法制备的芝麻饼粕蛋白质溶解性最好，这是由于蛋白酶对蛋白质的降解和改性，极性基团数目增加、多肽链平均分子量降低、蛋白质分子构象发生变化，从而使蛋白质亲水性增强，有利于蛋白质在水中的溶解［15］。

2.4 芝麻饼粕蛋白质的持水性和持油性的比较

碱溶酸沉法、超声辅助碱提法和蛋白酶法制备的芝麻饼粕蛋白质的持水性分别为0.880 7、1.444 9、1.671 35 g／L；持油性分别为2.12、2.708 5、2.258 g／L。由图2可知，3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质的持水性和持油性均有显著性差异（P＜0.05），且PE＞PU＞PA。PU的持水性高于PA，这是因为超声波的改性作用使蛋白质结构疏松，极性基团展开，能够吸附大量的水分子［16-17］。与PA和PU相比，PE的持水性提高了15.68%。这主要是因为蛋白质分子被酶解后，大量亲水基团外露的缘故。

图2 3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质的持水性和持油性

在许多食品和生物体系中，蛋白质和脂类之间存在着相互作用，这作用是脂类的非极性脂肪族链和蛋白质的非极性键之间的疏水相互作用［16］。与PA相比，PU的持油性提高了，这是因为超声波的改性作用使芝麻饼粕蛋白质结构疏松，疏水性氨基酸残基数增加，能与脂类强烈的相互作用，形成脂质-蛋白质络合物。而PE的持油性更高，可能是因为经蛋白酶水解，芝麻饼粕蛋白质链的高级结构被打开，使得疏水性氨基酸残基数增加，持油性能提高［17-18］。

2.5 芝麻饼粕蛋白质的乳化性及乳化稳定性的比较

由图3可知，芝麻饼粕蛋白质在等电点附近（pH 4）时乳化性最差，而在偏离等电点的酸性和碱性条件下乳化性较好。芝麻饼粕蛋白质的pH-乳化性曲线与pH-溶解性曲线相似，可能都是由蛋白质分子表面的结构和带电荷性决定的。

图3 3种芝麻饼粕蛋白质的乳化性随pH的变化

PU与PA的乳化性差异较小，而PE的乳化性明显优于PU和PA。蛋白酶解引起蛋白质乳化性发生改变，主要原因是芝麻饼粕经过蛋白酶的适度水解，使得蛋白质的溶解度增大，有利于蛋白质在油／水界面扩散并定位，因此乳化性增强［19］。

K值与ESI成正相关，K值越大，则ESI越大。由图4可知，在pH＜6范围内，PU比PA的乳化稳定性好，在pH＞6范围内则刚好相反。在不同的pH条件下，PE的乳化稳定性差异较小，但高于PU和PA。蛋白酶的水解作用使得疏水基团暴露于分子表面，有利于蛋白质分子在油水界面上的有序排列，提高乳浊液的稳定性［20-21］。

图4 3种芝麻饼粕蛋白质的乳化稳定性随pH的变化

2.6 芝麻饼粕蛋白质的起泡性及起泡稳定性的比较

由图5可知，3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质的起泡性及起泡稳定性均有显著性差异（P＜0.05），且PE＞PU＞PA。PU的起泡性及泡沫稳定性优于PA，这是因为超声处理使得芝麻饼粕蛋白的极性基团展开，有利于形成蛋白质薄膜，使水的表面张力迅速降低，提高起泡性和起泡稳定性［16，22］。

图5 3种芝麻饼粕蛋白质的起泡性及起泡稳定性

与PU相比，PE的起泡性与泡沫稳定性分别提高了25%和11.07%。蛋白质的起泡性及起泡稳定性与溶解性密切相关，蛋白酶水解后蛋白质溶解性提高，紧密的蛋白质分子变松散，疏水性氨基酸侧链暴露，使蛋白质快速定位至泡沫表面，提高蛋白质的起泡性及起泡稳定性；同时有利于多肽链的交联，形成一定的黏层，提高蛋白质起泡稳定性［21，23］。

3 结论

3.1 碱溶酸沉法、超声辅助碱提法和蛋白酶法3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质PA、PU和PE的氨基酸组成存在一定差异，但差异较小，且均含有丰富的必需氨基酸，谷氨酸、精氨酸等非必需氨基酸含量也均较高。3种工艺制备的芝麻饼粕蛋白质中除赖氨酸含量稍低外，其他必需氨基酸组成均接近或高于FAO／WHO模式，所以3种工艺制备的蛋白质均具有良好的营养价值。

3.2 碱溶酸沉法制备的芝麻饼粕蛋白质的相对分子质量为 11 789、9 990、4 981、2 975、1 963、1 005、1 901和 94，分别占总量的 49.90%、28.84%、6.23%、2.73%、2.73%、1.97%、2.79%、4.79%；超声辅助碱提法制备的芝麻饼粕蛋白质的相对分子质量为 11 878、9 990、4 981、2 975、1 963、1 005、190和92，分别占总量的48.59%、26.28%、6.19%、2.92%、3.06%、2.39%、3.6%、6.97%；而蛋白酶法制备的芝麻饼粕蛋白质吸收峰相对分子质量为9 999、4 985、2 978、1 965、1 295、678、250和 177，分别占总量的1.65%、9.5%、8.23%、6.78%、11.98%、17.42%、25.59%、18.84%。

3.3 PA、PU和PE溶解性顺序为：PE＞PU＞PA，三者均在等电点（pH 4）时最低，分别为7%、40.23%和72.5%。

3.4 PA、PU和PE的持水性、持油性、起泡性及起泡稳定性均有显著性差异，且PE＞PU＞PA。与PU相比，PE的持水性和持油性分别提高了15.68% 和20.31%，起泡性与起泡稳定性分别提高了25%和11.07%。

3.5 蛋白质的pH-乳化性曲线与pH-溶解性曲线相似，乳化性和溶解性均为等电点最低，偏离等电点的酸性和碱性条件下较高。与PU相比，PE的乳化性及乳化稳定性均有一定程度的提高。在pH＜6范围内，PU的乳化稳定性比PA的乳化稳定性好，而在pH＞6范围内则相反；PE的乳化稳定性最好。

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