杨永环 刘东 汤晓阳 王兴媛

摘 要：本文测定了3个不同厂家的医用羧甲基壳聚糖的等电点，验证了《医用羧甲基壳聚糖》（YY 0953—2015）中等电点测定方法的可行性和可靠性，最后得出結论，为标准方法的实施提供参考。

关键词：羧甲基壳聚糖;等电点;医用;测定方法

Abstract： This paper determined the isoelectric point of medical carboxymethyl chitosan from three different manufacturers， and verified the feasibility and reliability of the isoelectric point determination method in "Medical Carboxymethyl Chitosan" （YY 0953—2015）， finally drawn a conclusion to provide a reference for the implementation of standard methods.

Keywords： carboxymethyl chitosan;isoelectric point;medical;determination method

壳聚糖可由甲壳素脱乙酰化得到，是自然界中广泛存在的碱性多糖，壳聚糖具有生物可降解性强、生物相容性好、细胞毒性低和储量大等特征[1]。作为一种生物糖类聚合物，它是促进软组织修复的生物材料，广泛应用于皮肤伤口愈合、引导骨和软骨再生以及骨关节炎的治疗[2-3]。

由于壳聚糖不溶于水和有机溶剂，只溶于稀酸，因此壳聚糖的应用受到限制。羧甲基壳聚糖是壳聚糖最重要的衍生物之一，羧甲基壳聚糖相比壳聚糖有更好的生化及物理特性，并且溶解性更好，尤其是在中性和碱性溶液中，其溶解性显著增强，使其具有成膜、增稠、保湿、螯合等特性，因而能够广泛应用于农业、食品、医药和化妆品等领域。在医疗器械行业中，目前市场上常见的产品有壳聚糖护创海绵、外用壳聚糖抗菌液、壳聚糖敷料等。羧甲基壳聚糖溶液对pH敏感，存在等电点，在试验的过程中，人们发现，同是羧甲基壳聚糖，但不同厂家产品的等电点有很大的差异。本文详细介绍了羧甲基壳聚糖等电点的测定，目的为验证《医用羧甲基壳聚糖》（YY 0953—2015）中等电点试验方法的可行性和可靠性。

1 试验流程

1.1 试验样品

试验样品有三种。一是医用羧甲基壳聚糖，产自烟台万利医用品有限公司;二是羧甲基壳聚糖，产自赛克赛斯生物科技股份有限公司;三是羧甲基壳聚糖，产自石家庄亿生堂医用品有限公司。

1.2 主要仪器和试剂

主要仪器包括：电子分析天平，梅特勒-托利多XPE205;紫外可见分光光度计，Agilent Cary 60;多参数测定仪，梅特勒-托利多;恒温磁力搅拌器，巩义市予华ZNCL-BS230;离心机：SIGMA 3-30K。主要试剂为盐酸。

1.3 试验方法

1.3.1 供试液制备。分别称取羧甲基壳聚糖0.50 g和1.00 g，将其置于两个500 mL烧杯中，加蒸馏水300 mL，搅拌，完全溶解后转移至500 mL容量瓶中，定容，配制成质量浓度分别为0.1%和0.2%的溶液。

1.3.2 供试液pH梯度调节。将供试液分装在10个100 mL烧杯中，每杯为30 mL，用恒温磁力搅拌器不断搅拌，缓慢向其中滴加0.05 mol/L的盐酸，用pH计连续测定溶液pH，调节每杯pH分别为5.2、5.0、4.8、4.6、4.4、4.2、4.0、3.8、3.6、3.4，然后用滤纸过滤掉不溶物或离心，以蒸馏水为空白，测定滤液250 nm处的透光率。

1.3.3 结果处理。以透光率为纵坐标，pH值为横坐标，绘制T-pH曲线，观察透光率发生突变的点，羧甲基壳聚糖的等电点为透光率突跃为最大的pH值。

2 检测结果

2.1 烟台万利样品数据

在不同pH的条件下，质量浓度0.1%和0.2%的样品在250 nm处的透光率如表1所示。质量浓度为0.2%的样品，在pH为5.2～4.6时，溶液呈透明凝胶状，用滤纸很难过滤，在pH为4.4时，溶液流动性变好。质量浓度0.1%的样品，在pH值为5.2～4.6时，溶液呈透明凝胶状，用滤纸也不容易过滤，但稍好于质量浓度为0.2%的样品。所以，用紫外分光光度计测透过率时，本研究只过滤了pH为4.4～3.4的样品。由图1可以看出，在0.1%和0.2%的质量浓度下，烟台万利样品的透光率均在pH=3.6时发生突变，其等电点为3.6。

2.2 赛克赛斯样品数据

在不同pH的条件下，质量浓度0.1%和0.2%的样品在250 nm处的透光率如表2所示。不管是质量浓度为0.1%还是0.2%，在不同pH下，塞克塞斯样品用滤纸均难过滤，所以本研究采用离心后来测不同pH条件下的透光率。由图2可以看出，在质量浓度为0.1%和0.2%的条件下，塞克塞斯样品的透光率均在pH=4.0时发生突变，但是与烟台万利样品相比，透光率突变不是太明显。

2.3 石家庄亿生堂样品数据

在不同pH的条件下，不同质量浓度在250 nm处的透光率如表3所示。由图3可以看出，在0.1%和0.2%的质量浓度下，石家庄亿生堂样品的透光率均在pH=4.0时发生突变。

3 验证结论

3.1 样品质量浓度

在质量浓度为0.05%～0.5%时，根据三个样品的滴定情况，笔者发现，羧甲基壳聚糖质量浓度不能太大。烟台万利和石家庄亿生堂样品质量浓度适宜保持在0.1%～0.3%，赛克赛斯样品质量浓度适宜保持在0.1%～0.2%。

3.2 盐酸的浓度

在调节pH时，笔者试验了不同的盐酸浓度，所用盐酸浓度不能大于0.1 mol/L，否则滴定时形成气泡包夹溶液，很难搅拌开，盐酸浓度取0.05 mol/L较为合适。

3.3 过滤

调节好溶液的pH后，用滤纸过滤掉不溶物，当pH较高时，不同质量浓度溶液的过滤效果稍有差别。例如，在pH为4.2～5.2时，由于溶液较浓，滤纸很难过滤掉不溶物。

3.4 离心

调节好溶液的pH后，如果选择离心后测透光率，那么离心转速和离心时间对最后的试验数据有一定影响，本研究选择的离心条件是6 000 r/min，离心10 min。

3.5 等电点

羧甲基壳聚糖等电点不是固定的，不同厂家的样品等电点有一定的差别。

参考文献：

[1]Kean T，Thanou M.Biodegradation，biodistribution and toxicity of chitosan[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2010（1）：3-11.

[2]于玛丽，李丽梅，郭家智，等.壳聚糖在组织工程的应用[J].中国高新科技，2019（3）：103-105.

[3]CHEN Z，DENG S，YUAN D C，et al.Novel nano-microspheres containing chitosan，hyaluronicacid，and chondroitin sulfate deliver growth and differentiation factor-5 plasmid for osteoarthritis gene therapy[J].Journal of Zhejiang University Science B ，2018（12）：910-923.