姜胜莹，曹建彪，范公忍

原发性肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)是临床常见恶性肿瘤之一，发病率和病死率均较高［1-2］，对其早发现、早诊断以及早治疗具有重要意义。研究证实，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3，GPC-3)与原发性肝细胞癌的发生、发展以及诊疗密切相关［3-5］，其诊断敏感性和特异度较甲胎蛋白(alpha-Fetoproteins，AFP)均有增高，被认为是一种新型重要的HCC肿瘤标记物［6-7］，二者联合检测可提高HCC早期诊断率［8］。有研究发现，GPC-3与HCC的分化程度及转移复发有关［9］，也有研究表明GPC-3表达与肿瘤病理分级和临床分期有关［10］，本文旨在探讨GPC-3对HCC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年1月—2012年7月北京军区总医院全军肝病治疗中心住院的HCC 59例为HCC组，均符合2011年版《原发性肝癌诊疗规范》中诊断标准，并经病理学、影像学确诊，入院前未接受放疗、化疗、免疫治疗或中药治疗等。男51例，女8例;年龄36～79岁。选择同期该院确诊的肝硬化住院患者35例为肝硬化组，均符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会修订的《病毒性肝炎防治方案》标准，男26例，女9例;年龄30～76岁;肝功能分级均与HCC组在同一水平。选择同期该院健康体检中心体检者30例为健康对照组，男17例，女13例;年龄27～66岁;经检查各型肝炎病毒标志物及AFP均为阴性，无心、肝、肺、肾功能异常。3组性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 材料与方法 受检者在入院后均清晨空腹采集静脉血3 ml，不抗凝，1000 r/min离心5 min，留取血清转移至另一清洁的EP管内放置于－70℃冰箱内保存，统一检测。血清GPC-3测定采用酶联免疫定量法检测，ELISA试剂盒购自美国R＆D公司(编号为DY2119)，计算平均光密度值(optical density，OD值)，通过使用计算机软件产生四参数逻辑(4-PL)曲线拟合，从而创建GPC-3浓度的标准曲线，根据OD值计算每个样品中GPC-3的含量;AFP检测采用电化学发光免疫法测定，使用同型配套试剂，检测值＞200 ng/ml者为阳性，各项操作均按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，成组资料组间比较采用t检验，计数资料以率(%)表示，采用Pearson χ2检验，影响因素采用Logistic回归模型分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 GPC-3浓度标准曲线 以GPC-3标准品连续2倍逐级稀释浓度为横坐标，以光密度结果检测值为纵坐标，绘制标准曲线，直线回归方程为:Y=0.0003X －0.0014，相关系数 r≈1，见图1。

图1 酶联免疫定量法检测血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3浓度标准曲线

2.2 血清中GPC-3和AFP浓度检测 HCC组血清GPC-3表达水平和AFP含量均明显高于肝硬化组及健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，肝硬化组血清GPC-3表达水平和AFP含量与健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 3组血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白浓度检测结果(±s)

表1 3组血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白浓度检测结果(±s)

注:与肝硬化组及健康对照组比较，aP＜0.05

组别 例数 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(pg/ml)甲胎蛋白(ng/ml)原发性肝细胞肝癌组 59 938.00 ±404.67a285.64 ±452.39a肝硬化组 35 338.00 ±238.00 4.54 ±5.39健康对照组30 304.67 ±204.67 1.97 ±1.52

2.3 血清GPC-3浓度检测的ROC曲线 根据上述3组人群GPC-3检测结果绘制特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)，见图 2。曲线下面积为0.912，95%可信区间为0.859～0.965，当取GPC-3为601.33 pg/ml是判断HCC的界值时，GPC-3诊断 HCC的敏感性为89.3%，特异度为90.8%，阳性预测值为 89.3%，阴性预测值为86.8%。以200 ng/ml为 AFP阳性界值，HCC组AFP阳性率为32.2%(19/59)，以601.33 pg/ml为GPC-3阳性界值，HCC组GPC-3阳性率为84.7%(50/59)。AFP与GPC-3联合检测可使HCC的确诊率提高至88.1%(52/59)。

图2 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3浓度检测的ROC曲线

2.4 HCC组GPC-3表达与AFP水平及临床参数的Logistic回归模型分析 对HCC组血清中GPC-3表达水平为因变量(Y=1，GPC-3＞601.33 pg/ml;Y=2，GPC-3≤601.33 pg/ml)，以年龄、性别、有无门脉癌栓、有无远处转移、TNM分期、Child-pugh分级、有无HBsAg感染、AFP水平、肿瘤最大直径为自变量，进行Logistic回归模型分析，结果显示GPC-3表达与年龄、性别、有无门脉癌栓、TNM分期、Child-pugh分级、有无HBsAg感染、AFP水平及肿瘤最大直径均无相关性(P＞0.05)，而仅与有无远处转移有高度相关性(P＜0.05)，见表2。

表2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3表达与甲胎蛋白水平和临床参数Logistic回归模型分析

3 讨论

GPC-3属于膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)超家族成员，主要通过糖基(GPI)锚定于细胞膜上［11］，GPC-3基因位于人类的X染色体(Xq26)上，全长大约900 kb，其编码的含580个氨基酸的核心蛋白质前体可裂解生成1个40 kDa氨基(N)端蛋白和1个30 kDa膜结合羧基(C)终端蛋白，2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链连接到C-末端，参与信号间的传递［12］，通过多种信号通路直接调控肿瘤细胞增殖、分化、黏附及转移等过程［13-15］，尤其在HCC组织中发挥了重要作用［16-17］，GPC-3在核心蛋白下游富含半胱氨酸结构区的下端，即第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被酶切割而分成2段，使N-端约含40 kDa的GPC-3蛋白成为可溶性蛋白片段而分泌入血，这是外周循环血清能够检测GPC-3的分子生物学基础。

本研究采用酶联免疫定量法检测GPC-3标准品浓度，结果显示，本实验的标准曲线近似直线，相关系数接近1，说明曲线拟合度较好，实验结果具有较好的重复性。同时检测了59例HCC、35例肝硬化及30例健康体检者中 GPC-3表达水平，发现HCC组血清GPC-3呈现高表达，而在肝硬化组及健康对照组呈现低表达甚至无表达。本研究采用ROC曲线法，标定GPC-3为601.33 pg/ml是诊断HCC的阳性界值，敏感性为 89.3%，特异度为90.8%，阳性预测值为 89.3%，阴性预测值为86.8%;HCC组AFP阳性率为32.2%，GPC-3阳性率为84.7%，AFP与GPC-3联合检测可使HCC确诊率提高至88.1%。研究发现，HCC患者血清GPC-3浓度明显高于肝炎后肝硬化、慢性肝炎等肝脏良性病变患者及健康对照组［18-20］。江枫等［21］应用ELISA检测计算发现当以3.19 μg/ml为诊断界值时，GPC-3诊断HCC的敏感性和特异度分别为85.4%及98.9%，进一步发现，GPC-3能显著提高小肝癌与肝硬化结节的鉴别诊断。吴诗品等［22］研究显示HCC组血清GPC-3浓度明显高于肝内良性占位组和正常对照组，根据 ROC曲线，取412.6 pg/ml为诊断界值时，GPC-3诊断HCC的敏感性和特异度分别为63.2%和89.3%。付顺军等［23］研究结果显示，HCC患者血清中 GPC-3浓度明显高于肝硬化患者和健康者，而肝硬化患者和健康者比较差异无统计学意义，诊断HCC的敏感性和特异度分别为88.1%和85.9%。Zhang等［24］利用磁粒子为基础的酶联免疫化学发光技术(CLEIA)测定正常肝脏、肝硬化、继发性肝癌及原发性肝癌患者血清中GPC-3的浓度，发现GPC-3在原发性肝癌患者的血清中高表达，而在正常成人、肝炎、肝硬化中无表达或低表达，可有效的诊断原发性肝癌，是HCC的一个重要且有效的肿瘤标记物。因此我们认为GPC-3有可能成为替代AFP，或更有价值的肝癌标志物分子。

本研究进一步结合临床参数进行Logistic回归模型分析后发现，GPC-3表达仅与有无远处转移呈高度相关，而有无远处转移和HCC的预后密切相关，因此我们推测GPC-3的高表达在某种程度上与HCC预后相关。Yao等［25］研究发现HCC患者血清中AFP及GPC-3蛋白分布量不具有相关性，本研究结果与该文献报道一致。王攀等［26］研究显示，血清中GPC-3和AFP的表达均与HCC的临床分期、病理分级、肝硬化程度有关。也有研究发现肝癌患者GPC-3 mRNA的表达与血清AFP水平、门脉癌栓、肝内转移、HBsAg及年龄等不相关，而与肿瘤直径有关［27］。不同学者得出不同结论，GPC-3的表达与HCC预后的关系尚无明确结论，期待更多相关研究进一步证实。

综上所述，GPC-3在HCC诊断中有较高的敏感性和特异度，尤其是在AFP阴性的HCC中，可成为诊断HCC重要的肿瘤标志物之一，其表达与HCC有无远处转移有关，由于本文观察例数较少，有关机制和实验结论尚需进一步深入研究。

［1］成薇婷，田德英.原发性肝细胞癌组织Shh和Ptch-1与GLI-2表达及生物学意义的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2009，16(3):200-203.

［2］崔连鸷，于秀艳.300例原发性肝癌乙肝两对半及抗-HCV检测结果分析［J］.中国实验诊断学，2012(2):315-316.

［3］Lin C W，Mars W M，Paranjpe S.Hepatocyte proliferation and hepatomegaly induced by phenobarbital and 1，4-bis［2-(3，5-dichloropyridyloxy)］benzene is suppressed in hepatocyte-targeted Glypican-3 transgenic mice［J］.Hepatology，2011，54(2):620-630.

［4］Ho M，Kim H.Glypican-3:a new target for cancer immunotherapy［J］.Eur J Cancer，2011，47(3):333-338.

［5］余彬彬，曹骥，欧超，等.肝癌组织GPC-3mRNA和IGFⅡmRNA表达及其临床意义的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2008，15(15):1159-1162.

［6］Tangkijvanich P，Chanmee T，Komtong S.Diagnostic role of serum glypican-3 in differentiating hepatocellular carcinoma from non-malignant chronic liver disease and other liver cancers［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25(1):129-137.

［7］Wang H L，Anatelli F，Zhai Q J，et al.Glypican-3 as a useful diagnostic marker that distinguishes hepatocellular carcinoma from benign hepatocellular mass lesions［J］.Arch Pathol Lab Med，2008，132(11):1723-1728.

［8］于璐，范方淑，张曦，等.GPC-3与AFP在肝硬化异型增生结节及肝细胞癌中的表达及意义［J］.昆明医学院学报，2011(10):32-35.

［9］Ning S，Bin C，Na H.Glypican-3，a novel prognostic marker of hepatocellular cancer，is related with postoperative metastasis and recurrence in hepatocellular cancer patients［J］.Mol Biol Rep，2012，39(1):351-357.

［10］宋孟锜，杨永飞，王冬冬，等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和甲胎蛋白联合检测对原发性肝癌的诊断价值［J］.临床肝胆病杂志，2011，27(4):391-393，399.

［11］Zhang L，Liu H，Sun L，et al.Glypican-3 as a potential differential diagnosis marker for hepatocellular carcinoma:a tissue microarray-based study［J］.Acta Histochem，2012，114(6):547-552.

［12］Ho M.Advances in liver cancer antibody therapies:a focus on Glypican-3 and mesothelin［J］.BioDrugs，2011，25(5):275-284.

［13］康凯夫，张艳丽.DLK1和GPC-3在不同肝组织的表达及其临床意义［J］.中国现代医学杂志，2011，21(28):3499-3502.

［14］卞银珠，姚登福.GPC-3异常表达、信号通路及肝癌的靶向治疗［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2011，20(1):11-14.

［15］Liu S，Li Y，Chen W，Zheng P，et al.Silencing Glypican-3 expression induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，419(4):656-661.

［16］Nobuoka D，Motomura Y，Shirakawa H，et al.Radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma induces glypican-3 peptide-specific cytotoxic T lymphocytes［J］.Int J Oncol，2012，40(1):63-70.

［17］吴飞翔，黄山，马良，等.肝癌细胞中与Glypican-3相关的信号转导分子表达分析［J］.中国肿瘤，2011，20(7):521-524.

［18］Wang F H，Yip Y C，Zhang M.Diagnostic utility of Glypican-3 for hepatocellular carcinoma on liver needle biopsy［J］.J Clin Pathol，2010，63(7):599-603.

［19］Yasuda E，Kumada T，Toyoda H，et al.Evaluation for clinical utility of GPC-3，measured by a commercially available ELISA kit with Glypican-3(GPC-3)antibody，as a serological and histological marker for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol Res，2010，40(5):477-485.

［20］刘斐烨，苏宁，梁继珍，等.Glypican-3蛋白在肝癌患者血清中的表达及意义［J］.山东医药，2010，50(1):55-56.

［21］江枫，肖明兵，倪润洲，等.血清Glypican-3 ELISA检测法的建立及初步应用［J］.临床检验杂志，2011，29(4):244-246.

［22］吴诗品，刘真真，杨智.外周血磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3检测在原发性肝癌诊断中的意义［J］.中国现代医学杂志，2011，20(21):3271-3274.

［23］付顺军，李绍强，林杰，等.Glypican-3在原发性肝细胞癌中的表达及其对预后的影响［J］.中国病理生理杂志，2010，26(12):2351-2357.

［24］Zhang Q Y，Chen H，Lin Z，et al.Chemiluminescence enzyme immunoassay based on magnetic nanoparticles for detection of hepatoceUular carcinoma marker Glypican-3［J］.Journal of Pharmaceutical Analysis，2011，1(3):166-174.

［25］Yao M，Yao D F，Bian Y Z.Oncofetal antigen Glypican-3 as a promising early diagnostic marker for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2011，10(3):289-294.

［26］王攀，郑志保，李招云，等.荧光定量RT-PCR检测肝细胞癌患者GPC3 mRNA和AFP mRNA的诊断价值［J］.中国卫生检验杂志，2011，21(6):1448-1450.

［27］Sun C K，Chua M S，He J.Suppression of Glypican-3 Inhibits Growth of Hepatocellular Carcinoma Cells through Up-Regulation of TGF-beta2［J］.Neoplasia，2011，13(8):735-747.