于永洋 王思力* 黄 耘 蒋 平

（1 厦门大学附属第一医院普外科，福建 厦门 361003；2 厦门大学附属第一医院血液科，福建 厦门 361003；3 厦门大学附属第一医院血液科，福建 厦门 361003；4 温州医学院附属第二医院普外科，浙江 温州 325000）

XELOX方案化疗后外周血淋巴细胞对肿瘤杀伤能力的影响

于永洋 王思力* 黄 耘 蒋 平

（1 厦门大学附属第一医院普外科，福建 厦门 361003；2 厦门大学附属第一医院血液科，福建 厦门 361003；3 厦门大学附属第一医院血液科，福建 厦门 361003；4 温州医学院附属第二医院普外科，浙江 温州 325000）

目的 研究胃癌手术后患者在接受卡培他滨联合奥沙利铂化疗前、后外周血淋巴细胞对人胃癌细胞株NCI-N87杀伤能力的改变，并探讨其临床意义。方法 对22例次（13人）接受卡培他滨联合奥沙利铂化疗方案的胃癌患者，分离化疗前及化疗后10d左右的外周血淋巴细胞，PHA-L培养48h，检测对人胃癌NCI-N87细胞的杀伤效应。结果 XELOX方案化疗后的T淋巴细胞对NCI-N87细胞杀伤活性为（12.61 ±1.36）（化疗前为14.36±1.68），t检验P=0.236，无统计学意义。化疗后外周血淋巴细胞对NCI-N87细胞平均杀伤率为6.55%，与化疗前（平均为6.96%）相比，P=0.370，无统计学意义。结论 不能认为XELOX方案化疗后的T淋巴细胞免疫杀伤功能较化疗前下降。

卡培他滨；奥沙利铂；淋巴细胞；胃癌；免疫重建

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤，化疗在胃癌的综合治疗中占有重要地位，有研究显示胃癌患者应用奥沙利铂联合卡培他滨化疗治疗近期有效率达46.1%[1]，与FOLFOX方案疗效相似，但此方案毒副作用较轻，且患者大部分时间可以在家中口服治疗，减少了住院时间，提高了生活质量，有广阔的应用前景。

由于化疗不仅对肿瘤细胞具有杀伤作用，对正常淋巴细胞亦有杀伤，所以往往认为放、化疗后容易产生免疫负应答，造成对肿瘤的免疫耐受。然而，近年来的临床试验发现，肿瘤患者放、化疗后进行免疫生物治疗不仅没有诱导产生免疫耐受，反而获得了很好的抗肿瘤免疫效果[2-3]。因此，本文XELOX方案化疗后外周血淋巴细胞对肿瘤杀伤能力的影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 临床资料

病例选自2009年1月至2011年12月间在我院普外科住院的确诊胃癌患者，共22例次（13人），包括乳头状腺癌5例，低分化管状腺癌2例，印戒细胞癌1例，中分化腺癌5例；其中男9例，女4例，年龄41～72岁，平均年龄58.7岁。全部患者均为行胃癌根治术术后，排除高血压、糖尿病、免疫系统疾病及肝肾疾病患者。其中17例次（化疗组）以“奥沙利铂+卡培他滨”方案进行化疗，具体方案：第1天奥沙利铂130mg/m2静脉注射，第1～14天卡培他滨1000 mg/m2·d口服，每3周为1个周期。化疗组的患者中，部分患者进行1次化疗；部分患者在1次化疗结束后再次进行化疗，最多化疗4次。另5人（5例次）未行化疗，作为对照组。

1.2 标本采集

所有研究对象在化疗前、后定期抽取空腹静脉血标本做血常规检查。部分血样经肝素抗凝后留作他用。化疗后早期血样在患者化疗开始后4～7d内采集，化疗后晚期血液样本在患者一次化疗开始后9～11d内采集，所有血液样本均在未使用升白细胞药物或其他免疫药物前采集，化疗期间均无急性感染发生。另外采集未化疗患者的血样为对照组，时间间距与化疗组相同，并服用安慰剂。

1.3 细胞株

人胃癌NCI-N87细胞株购于中国生命科学院上海细胞库，10%胎牛血清RPMI 1640培养，在体外杀伤实验中作为靶细胞。

1.4 药物

奥沙利铂（OXA），商品名艾恒，江苏恒瑞医药股份有限公司制造。卡培他滨（Capecitabine）， 商品名希罗达（Xeloda），瑞士巴塞尔豪夫迈·罗氏有限公司制造。

1.5 实验方法

1.5.1 离心法分离胃癌术后患者外周血单核淋巴细胞。

1.5.2 细胞培养

NCI-N87细胞株在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，使活细胞数＞95%。

1.5.3 淋巴细胞杀伤实验

将化疗前、化疗后10d左右胃癌术后患者外周血单核淋巴细胞按20∶1的比例与NCI-N87靶细胞混合，流式细胞仪检测靶细胞存活情况。

1.5.4 CCK-8法检测化疗前、后患者外周血淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性

细胞杀伤率（%）=[1-（实验组A-本底值）/（空白组A-本底值）]×100%。

1.5.5 统计学处理

本实验数据采用SPSS 11.5统计软件进行分析，实验数据均以（）表示，两两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 用CCK-8法检测胃癌术后患者化疗后外周血淋巴细胞对人胃癌NCI-N87细胞的杀伤活性，结果显示，对照组（同时间点）、化疗组化疗前后外周血淋巴细胞对人胃癌NCI-N87细胞株的杀伤活性变化无统计学意义。以上试验表明，并不能认为化疗后增生的T淋巴细胞对肿瘤细胞的抑制作用有所减弱。见表1。

2.2 流式细胞仪检测胃癌术后患者化疗后淋巴细胞杀伤能力的变化

结果显示，对照组（同时间点）、化疗组化疗前后外周血淋巴细胞对人胃癌NCI-N87细胞株的杀伤活性的变化无统计学意义；所以，还不能认为化疗前、后患者外周血淋巴细胞对人胃癌NCI-N87细胞株的杀伤活性有变化。另外我们发现有1例样本化疗后淋巴细胞杀伤率有明显上调（化疗前为6.25%，化疗后为11.21%），此现象是否由于化疗增强了部分患者的淋巴细胞的杀伤能力。见表2。

表1 化疗前后外周血淋巴细胞对NCI-N87细胞杀伤活性的影响

表2 化疗前后外周血淋巴细胞对NCI-N87细胞杀伤率的影响

3 讨 论

为了明确胃癌术后患者化疗后外周血淋巴细胞对肿瘤杀伤能力与化疗前相比较有无变化，我们分别用CCK-8法和流式细胞术检测了不同胃癌术后患者化疗前、后外周血中淋巴细胞对肿瘤的杀伤效应。我们研究结果显示，患者化疗后体外培养的淋巴细胞对人胃癌NCI-N87细胞杀伤作用较化疗前并没有下降，部分病例还有一定程度的上调。以上结果可能与化疗后期增生的记忆样T细胞对抗原刺激敏感，活化阈值降低有关，表明胃癌术后患者化疗后的淋巴细胞仍然具有一定的免疫杀伤功能。

上述结果表明，胃癌患者化疗后免疫功能受到明显抑制的同时，化疗后新生的淋巴细胞对抗原刺激敏感，此时若给予肿瘤疫苗进行主动免疫或被动免疫，有可能诱导出增强的抗肿瘤免疫应答。另外，有研究证实[4]，化疗可以选择性地下调调节性T细胞的比例，解除调节性T细胞（Treg）对T效应细胞的免疫抑制作用，使得效应细胞更为有效地发挥免疫应答，即下调的Treg比例在化疗诱生的优化的免疫微环境中发挥了重要作用，这一方面的研究工作还有待于深入探讨。

本实验采用胃癌术后患者化疗前、后外周血为研究对象，证明了患者的淋巴细胞从淋巴细胞减少状态逐渐恢复后淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能并未下降，本实验结果与国内采用其他化疗方案的相关实验结果基本一致[4]。但是，化疗联合肿瘤免疫治疗的效用还需要更多高质量的临床实验来进一步验证[5]，设计更完善、安全、重复性高的治疗方案。

[1] 李瑞君,杨铁健.奥沙利铂联合希罗达行进展期胃癌新辅助化疗疗效观察[J].中国实用医药,2007,2(25):22-23.

[2] Soiffer R,Hodi FS,Haluska F,et al.Vaccination with irradiated, autologous melanoma cells engineered to secrete granulocytemacrophage colony-stimulating factor by adenoviral-mediated gene transfer augments antitumor immunity in patients with metastatic melanoma[J].J Clin Oncol 2003,21(17):3343-3350.

[3] Dudley ME,Wunderlich JR,Robbins PF,et al.Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes[J].Science,2002,298(5594):850-854.

[4] 储以微,刘荣军,张镭,等.肺癌患者化疗前后免疫细胞格局的改变及其临床意义[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2006,13(4):253-256.

[5] Nowak AK,Lake RA,Robinson BWS.Combined chemoimmunotherapy of solid tumours: Improving vaccines[J].Adv Drug Deliv Rev,2006,58(8):975-991.

R730.53

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1671-8194（2013）27-0144-02