陈文洁，张京震，郭建峰*

（1.中北大学 化工与环境学院，山西 太原 030051；2.山西省经济建设投资有限公司，山西 太原 030012）

乳酸钙是一种重要的化工原料，主要应用于食品、医药和饲料行业。在食品工业中，乳酸钙作为安全的食品添加剂，可用于固化剂、风味增强剂、调味剂、配料、食品松软剂、营养供应品及稳定剂和增稠剂使用；在医药行业是人和动物的主要补钙剂；在轻工行业作为抗菌剂和除垢剂用于牙膏中[1-3]。

由于目前乳酸钙的制备成本偏高，有效地降低乳酸钙生产成本对其市场应用具有积极的推动作用[4-5]。工业中淀粉废水的排放量与日俱增，会污染环境且造成资源浪费[6]。为了充分利用废水中的淀粉等资源，降低乳酸钙生产成本，试验通过葡萄糖作为乳酸菌生长发酵的碳源，对乳酸菌生长和发酵条件进行优化，探索最优发酵工艺条件，提高乳酸钙产量，为后续研究利用淀粉废水发酵提供理论依据和试验基础条件。以其为后期的应用探索合适发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌种

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）：试验室储藏；脱脂乳粉为市售。

1.1.2 培养基

MRS固体培养基：在MRS培养基中加入1.5%琼脂。发酵培养基：葡萄糖，酵母膏，MgSO4·7H2O，磷酸二氢钾。保藏培养基：在MRS培养基中加入1%的CaCO3。

1.2 仪器与设备

BS210电子天平：上海精密科学有限公司；YXQ-SG46-280S手提式高压蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2F无菌操作台：宁波科森净化器制造有限公司；DHP060型恒温培养箱：上海飞越试验仪器有限公司；PHS-3C精密pH计：杭州奥利龙有限公司；721可见分光光度计：上海第三分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

乳酸菌的活化：取一环生长良好的斜面种子，接入液体活化培养基中，至于36℃培养箱中培养，连续活化2次备用。乳酸菌富集培养：在无菌条件下，用移液管吸取一定量活化后的菌悬液，加入MRS培养基中，置于恒温培养箱中培养。

乳酸菌发酵产酸培养：在250mL锥形瓶中加入50mL发酵培养基，在无菌条件下，用移液管吸取一定量活化后的菌悬液，加入发酵培养基中，置于恒温培养箱中培养。

发酵法制取乳酸钙：将活化后的菌悬液接入添加有碳酸钙的发酵培养基中，在试验所得的最优条件下进行培养。

1.3.2 分析方法

（1）乳酸菌生长情况测定

用移液管吸取培养一定时间后的菌悬液，稀释5～10倍后，使用721分光光度计在波长660nm处测定其吸光度值。

（2）发酵产酸量测定

用0.1mol/L的NaOH对发酵液进行滴定，溴甲酚紫为指示剂，溶液由橙黄色变为蓝紫色即达到滴定终点[7]。记录滴定消耗NaOH的体积数，mL。

乳酸产量按下式计算：

式中：X 为乳酸产量，g/L；VNaOH为滴定消耗的氢氧化钠体积数，mL；90.08 为乳酸的摩尔质量，g/mol；V为样品的体积，mL。

（3）乳酸钙总量的测定

本试验通过乙二胺四乙酸二钠中和滴定法测定所产乳酸钙的总量[8]。

1.3.3 乳酸钙的提取方法

将在最佳条件下获得的发酵液过滤，以除去菌体及未反应的碳酸钙，在滤液中加入氧化钙调pH值至12～13，并加入0.4%的MgSO4沉聚菌体蛋白[9-11]，在80℃，搅拌反应30min后，趁热抽滤得乳酸钙母液，再将母液进行加热浓缩，当母液中乳酸钙质量浓度达到145g/L～15g/L[12-13]时，冷却静置结晶24h。分离晶体和母液，由于乳酸钙在水中的溶解度较大，结晶母液中还留有大量的乳酸钙，浓缩后再次结晶，合并晶体[14]。

1.3.4 乳酸菌生长条件单因素试验

（1）乳酸菌生长曲线的测定

制备7瓶50mL相同条件的MRS培养基，按2%的接种量接种，30℃条件下进行培养，在2h、5h、8h、12h、15h、20h、24h 后分别取出一瓶测其OD值，以确定菌种生长情况。

（2）不同pH值对乳酸菌生长情况影响

在6个装有50mL MRS培养基的锥形瓶中，添加氢氧化钠或乙酸调整培养基的起始pH值，分别为3.2、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，按2%的接种量接种，在30℃条件下进行培养，12h后测其生长情况。

（3）不同的培养温度对乳酸菌生长情况的影响

将装有50mL MRS培养基的锥形瓶灭菌后，按2%的接种量接种，分别放置于28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃、42℃条件下培养12h后，测量生长情况。

（4）不同的接种量对乳酸菌生长情况的影响

在装有50mL MRS培养基的锥形瓶中，用灭菌后的移液管分别接入2%、5%、8%、10%、12%、15%的乳酸菌菌悬液，在之前试验确定的最佳温度条件下培养12h后测其生长情况。

（5）不同的装液量对乳酸菌生长情况的影响

分别往6个250mL的锥形瓶中加入25mL、50mL、75mL、100mL、150mL、200mL的MRS培养基，并接入2%的乳酸菌菌悬液[15]，置于之前试验确定的最佳温度下培养12h后，分别测其生长情况。

1.3.5 发酵条件优化正交试验

将酵母膏、MgSO4·7H2O、磷酸二氢钾的用量固定，以酸度为考察指标，优化温度（A）、时间（B）、接种量（C）、葡萄糖含量（D）和初始pH值（E）为5个因素，设计L16（45）正交试验分析发酵培养基优化结果，因素水平见表1。

表1 发酵培养基优化L16(45)正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the L16(45) orthogonal experiment for fermentation medium optimization

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定

图1 菌种生长曲线Fig.1 The growth curve of lactic acid bacteria

菌液的OD值在一定程度上反映了菌体的生长情况，由图1可知，菌体经过较短的延迟期后即进入对数生长期，到12h时达到较高水平，此后虽然OD值一直增大但变化幅度趋于平稳，表明菌株此时进入稳定期。

2.2 乳酸菌生长条件单因素试验

2.2.1 初始pH值的影响

pH值是影响微生物生长代谢的一个重要因素，乳酸菌在生长过程中，对pH值有着严格的要求。37℃培养12h后，测其OD值，试验结果见图2。

图2 pH值对乳酸菌生长的影响Fig.2 Effect of pH value on the growth of lactic acid bacteria

由图2可知，在一定的pH值范围内，初始pH值越高，菌种生长越好，在pH值为6.0时，菌种达到最佳生长条件，随后pH值的增大会抑制菌种生长。因此，之后发酵优化中初始pH值选取在5.5～7.0的范围内。由于pH值在自然情况下，生长情况尚好，为方便起见，后期试验采用自然条件的pH值。

2.2.2 装液量的影响

装液量将直接影响培养基里的供氧量，过多将影响菌体的呼吸作用，菌体的生长将受到抑制，过少将浪费培养基里的氧气。本试验选取了10%～80%的装液量做单因素试验，37℃培养12h后，测其OD值，结果见图3。

图3 装液量对菌种生长的影响Fig.3 Effect of liquid volume on the growth of lactic acid bacteria

从图3可知，乳酸菌虽为兼性厌氧菌，但是装液量越少时，生长越好，由于10%的装液量过少，且20%的装液量效果尚佳，所以之后发酵选择20%的装液量。

2.2.3 接种量的影响

将活化后的乳酸菌种子培养基分别以2%、5%、8%、10%、12%、15%接种量接种于MRS培养基中，37℃培养12h后，测其OD值，结果见图4。

从图4可知，接种量为8%时，菌种生长最佳，在低于8%时，接种量越高，生长越好，当接种量高于8%时，生长量反而减少。由于2%～10%接种量的结果（OD值）差距不大，所以在活化菌种时为节约菌种采用2%的接种量，之后发酵水平选取在2%～10%的区间内。

图4 接种量对菌种生长的影响Fig.4 Effect of inoculum on the growth of lactic acid bacteria

2.2.4 温度对菌种生长的影响

乳酸菌的生长随温度变化，试验分别在28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃培养12h。OD值变化见图5。

图5 温度对菌种生长的影响Fig.5 Effect of temperature on the growth of lactic acid bacteria

从图5可知，乳酸菌生长OD值在32℃～38℃较高，在35℃～37℃达到最高水平。在此水平前，菌种随温度的升高而呈现良好的生长趋势，高于此水平温度时，菌种受高温的抑制，虽然可以生长，但生长变得缓慢。

2.3 菌种发酵条件的优化正交试验

在单因素试验的基础上，以滴定酸度为考察指标采，用L16（45）进行正交试验，结果见表2。由表2可知，最优组合为A4B4C3D4E4，即培养温度40℃，培养时间96h，接种量8%，葡萄糖含量10%，初始pH值为7.0。由极差大小可知，因素对菌种发酵产酸影响主次顺序为时间＞温度＞接种量＞葡萄糖含量＞初始pH值。

按照优选出的发酵培养基条件A4B4C3D4E4制备发酵培养基，葡萄糖含量为10%，初始pH值为7.0，接种量为8%，于40℃培养96h，其最终酸度为75°T。

2.4 乳酸钙的测定和提取

表2 发酵培养基优化的L16(45)正交试验结果与分析Table 2 Result and analysis of the L16(45) orthogonal experiment for fermentation medium optimization

在最优发酵条件的培养基中加入碳酸钙，其用量为乳酸产量的120%，即0.52g，按照最优条件进行发酵，反应结束后，用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定发酵液，测得乳酸钙含量为27.28g/L。

将4瓶50mL发酵液统一处理，通过纯化除杂，浓缩结晶得乳酸钙成品3.93g，计算得乳酸钙提取率为72.0%。

3 结论

单因素试验结果表明，乳酸菌种子培养基的最佳条件为接种量8%，装液量20%，温度36℃，初始pH值为6.0，接种后12h菌种活性较高，适合下一代的接种。对乳酸杆菌进行乳酸发酵优化后，确定了最佳发酵条件：时间96h，温度40℃，葡萄糖含量10%，接种量8%，初始pH值为7.0。各因素对发酵产酸的影响顺序为时间＞温度＞接种量＞碳源＞初始pH值。在最优条件下进行发酵，可得乳酸产量为8.64g/L，发酵液中乳酸钙含量可达27.28g/L。通过过滤除去菌体和未反应的碳酸钙，等电点沉淀法除去蛋白质，浓缩结晶提取乳酸钙。最终乳酸钙的提取收率为72%。该研究仅对菌种生长条件和发酵培养基条件进行了研究，葡萄糖转换率较低，今后可以对该菌进行诱变[16-17]以提高菌种性能和乳酸产量。

[1]TAY A,YANG S T.Production of L-lactic acid from glucose and starch by immobilized cells ofRhizopus oryzaein a rotating fibrous bed bioreactor[J].Biotechnol Bioeng,2002,80(10):1-12.

[2]赖谱富.利用花蛤壳制备乳酸钙的新工艺研究[D].福建：福建农林大学硕士论文，2009.

[3]陈黎洪，杨 颖，任发政，等.乳酸菌发酵法生产高钙鸡骨泥的工艺研究[J].中国食品学报，2011，11（2）：104-108.

[4]徐 忠，汪群慧，姜兆华.L-乳酸的制备及其应用的研究进展[J].化学与粘合，2004，214（4）：214-217.

[5]ALTAF M D,NAVEENA B J,VENKATESHWAR M,et al.Single step fermentation of starch to L (+) lactic acid byLactobacillus amylophilusGV6 in SSF using inexpensive nitrogen sources to replace peptone and yeast extract-optimization by RSM[J].Process Biochem,2006,41(2):465-472.

[6]苑广志.一株乳酸菌发酵条件优化及检测方法的建立[J].食品研究与开发，2012，33（11）：197-201.

[7]LEE C W.Production of D-lactic acid by bacterial fermentation of rice[J].Fibers Polym,2007,8(6):571-578.

[8]GB/T 5009.92-2003 食品中钙的测定[S].

[9]梅笑冰.食品添加剂乳酸钙制备工艺研究[D].西安：西北大学硕士论文，2009.

[10]王振铎.L-乳酸钙的生产工艺[J].山西食品工业，2000（1）：26-27.

[11]李逢振，马美湖，李彦坡，等.鸡蛋壳直接中和制取乳酸钙的工艺[J].农业工程学报，2010，26（2）：370-374.

[12]王 玉，吴 疆，吴家鑫.一株耐高温乳酸菌的发酵条件优化[J].食品研究与开发，2012，33（5）：161-164.

[13]孙天松，刘红霞，倪慧娟，等.传统发酵酸驼乳中乳酸菌的分离及鉴定[J].中国乳品工业，2006，39（6）：4-7.

[14]田国军，尚艳艳，黄泽元.腊鱼中优势乳酸菌的分离、纯化及性质鉴定[J].食品与发酵工业，2011，37（6）：78-81.

[15]JOHNR P,ANISHA G S,NAMPOOTHIRI K M,et al.Direct lactic acid fermentation:focus on simultaneous saccharification and lactic acid production[J].Biotechnol Adv,2009,27(2):145-152.

[16]凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999.

[17]鲁明波，曾 翔，张 力，等.紫外线诱变和恒化器培养筛选耐高温的高产乳酸菌[J].微生物学通报，2010，37（4）：520-523.