苏嘉妮 周 露

（广东省食品检验所 广东广州 510435）

1 前言

食品安全关乎民生大事，我国每年都会发生食物中毒事件，大部分是微生物污染引起的。食品微生物检验作为食品安全监测的重要手段，可以有效减少食源性疾病的发生[1]。CNAS-CL01-A001 2018《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》规定，实验室必须保存满足试验需要的菌种用于检验方法需要的阴阳性对照、培养基质量验收、方法确认、人员培训考核和结果质量保证[2]，因此，菌种的保存管理，对保证微生物实验过程的质量控制的有效性起到至关重要的作用。菌种保存是微生物检验工作中的常规技术，科学保存和管理关系到检验结果的准确性。

2 菌种的来源

2.1 标准菌种

至少定义到属或种水平的菌种，按菌种特性进行分类和描述，官方菌种保藏机构获得，最好来源于食品或水[3]。相关机构包括美国菌种保藏中心（ATCC）、中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）、工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC）等。

2.2 野生菌种

由日常检验样品或能力验证、盲样考核获得的可疑菌种，通过分离纯化，生理生化试验鉴定得到的野生菌种，或者通过其他途径（与他人交换、赠送）获得的非标准菌种，提供者需要提供菌种的鉴定材料，由实验室菌种管理人员登记入库。

3 菌种的管理

菌种的管理是实验室一项重要的工作，实验室用于实验质量控制和操作评估，保障实验结果的准确可靠。规范化的管理菌种，要求菌种的购买、验收、复苏、确认、传代、保存、使用、销毁有文件化的程序管理，进一步加强生物安全的管理，保护实验室人员和公众健康[4，5]。本实验室从人、机、料、法、环这几方面进行菌种的全面质量控制并形成记录，确保其溯源性和稳定性。

3.1 人员

菌种需要专人管理，管理人员负责菌种的申购、验收、复苏、验证、传代、保管。管理人员必须要有认真负责的态度，熟悉微生物检验操作，充分了解菌种的基础知识，经常积累工作经验，清楚知道各种菌种复苏传代保存所需最合适的培养基和培养条件。购买菌种要选择有资质的机构，菌种管理人员验收菌种时，要检查每一支菌种是否有质量证明或检验报告单，不仅要进行外观检查，还需进行纯度和特性的确认，确保菌种的活性。菌种管理人员从菌种接收当日，所有的活动都要形成记录并且详细登记，对每一支保存的菌种都有唯一性标识，包括菌种名称、菌种号、代数、日期，保证所有购入的菌种都有完整的身份可以追溯。

3.2 仪器设备

菌种的保存需要实验室配备相应的设备，包括低温冰箱、超低温冰箱、液氮罐、冷冻干燥机等，并实行“双人双锁”管理，对所有设备应进行监控并定期检查和保养，需要温度监控的设备应形成记录，发现不正常及时维修。

3.3 培养基

培养基是供微生物生长的养料，不同菌种应根据其生物学特性选择合适的培养基，以利于菌种的生长，以下介绍食品微生物实验室常用菌种的复苏、传代所用合适的培养基和培养条件，详见表1。

表1 菌种培养方法

3.4 菌种保存的方法

微生物具有容易发生变异的特性，因此，在保存菌种的过程中，应挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态的基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，或相对静止使微生物的代谢处于最不活跃的状态,才能在一定的时间内使其保持菌种原有的优良特性，低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境可抑制微生物的生长和繁殖[6]。菌种保存时，最好采用2种以上方法或尽可能存放在2 个以上的保藏设备，可避免因保存不当导致菌种死亡或菌种意外流失的情况发生。对于基层食品微生物实验室常使用以下方法对菌种进行保存[7]。

3.4.1 传代保存法

此法适用于保存工作菌种。根据菌种的特性选择适合于生长的培养基，纯化菌种转接于适宜的平板或琼脂斜面培养基、半固体培养基、液体培养基，经适当的温度和时间培养后，用封口膜将管塞部分包扎好置于4℃左右冰箱保存，特别注意铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、非O1/O139 群霍乱弧菌、创伤弧菌等需置于室温保存。传代保存时间因微生物种类不同而异，一般为一周至2～3 个月不等，该方法只适用于短期需要用的菌种保存。此法虽简单方便，但菌种多次传代易使菌种发生变异，微生物特性改变，因此，GB/T 27405—2008 《实验室质量控制规范 食品微生物检测》规定，工作菌种传代次数不超过5 代[8]。

3.4.2 液体石蜡保存法

液体石蜡要在121℃，30 min 高压灭菌，灭菌后放在烘箱中，160℃左右干燥1～2 h 或40℃恒温箱中干燥3 h，蒸发水分直至澄清透明。在传代培养法的基础上，培养后注入无菌液体石蜡，石蜡高度超过1 cm，使其覆盖整个斜面或半固体，达到菌体与空气隔绝，防止水分蒸发，减缓菌种代谢活动。将试管直立放在4℃左右冰箱保存，保存时间1年左右。保存期间要定期检查，发现液体石蜡露出菌体斜面时，应及时补充灭菌液体石蜡。

3.4.3 甘油保存法

此法适用于保存标准储备菌种。甘油是一种低温保护剂，低温有利于降低微生物的活性，甘油能渗透到细胞内，避免水结冰产生冰晶损伤细胞。将待保菌种通过肉汤增菌培养后，可用甘油原液保存，也可以用甘油—生理盐水保存液保存，甘油含量为20%～30%[9]，保存温度为-80～-60℃或-20℃左右，保存时间1～3年不等。

3.4.4 瓷珠保存法

此法较甘油保存法，时间更长久。将菌种接种至适宜的平板培养基，经适当温度时间培养后，直接刮取平皿上生长活力旺盛的新鲜培养物置于瓷珠保藏管，浓度达到3～4 麦氏浊度，来回颠倒摇匀使细菌或孢子有效地吸附在瓷珠表面（切勿涡旋震荡），尽可能将与菌种混匀后的保护液吸净，避免液体反复冻融形成冰晶对菌种造成损伤，加速复苏的过程。保存温度为-80～-60℃，保存时间3～10年不等。

3.5 菌种保存环境及生物安全

如何保证菌种长期有效的保存，环境的控制至关重要。低温环境可降低微生物的生长速度，因此，实验用工作菌种常存放在2～8℃，储备菌种存放在-20℃和-80℃。微生物菌种的保藏工作不能对周围环境造成污染和危害，实验过程中要无菌操作，做好个人防护，避免污染。对变异、污染、过期、使用后的菌种要及时销毁，灭菌条件为121℃，30 min，并做好相关记录。

菌种的管理应严格按照 《病原微生物生物安全通用要求》《人间传染的病原微生物名录》《动物病原微生物分类名录》及SN/T 2632—2010《微生物菌种常规保藏技术规程》的要求执行[10]。原则上，菌种不得外借，如果要带离实验室需上级批准，详细记录，确保安全。

3.6 菌种相关记录

记录是保证菌种溯源性的重要文件，因此，菌种的所有记录必须详细登记并存档，以下介绍标准菌种的验收、复苏、确认、传代、使用、销毁一切活动所需形成的记录供参考[11]。

3.6.1 菌种的验收

实验室在接收菌种时，应检查其外观的完整性，并索取标准菌种质量证明材料或检验报告单，相关证明需加盖资质机构的公章，并填写接收记录，内容包括：菌种基础信息（菌种名称、编号、代数、数量、基质类型）和菌种来源信息（菌种来源、购入时间、有效期）。

3.6.2 菌种的复苏

复苏是使用保藏菌种的第一步，活化菌种使其恢复旺盛的生命活力，按照菌种说明书的要求进行复苏。

3.6.3 菌种的确认

菌种活化后，需要进行菌种纯度和特性的确认，并填写确认记录，内容包括菌种名称、编号、验证依据、革兰氏染色、分离培养形态鉴定、生化试验、鉴定人员、结果判定。对鉴定结果符合的菌种才可以进行保存和传代。

3.6.4 菌种的传代

从具有资质认定资格的机构购买的质控菌种为0 代，菌种通过介质培养增加1 代，传代不超过5 代，填写传代记录表，内容包括：菌种名称、母代编号、代数、制成代编号、保种基质、数量、培养基、培养温度和时间、存放温度、保存时间、操作者。

3.6.5 菌种使用和销毁

菌种使用需经管理人同意，并填写领用记录，内容包括：菌种名称及编号、使用日期、用途、使用人和管理人签字确认。菌种销毁应严格遵守生物安全制度，填写销毁记录及灭菌记录。

4 结语

菌种作为重要的标准物质，实验室应制定符合实验室自身情况的菌种管理工作细则，并严格执行。菌种应从认可机构购买并附有证书。菌种保存需从人、机、料、法及环5 方面进行控制，并保证实验过程操作规范，避免菌种污染，同时注意生物安全，做好个人防护。实验室菌种的管理需要制定文件化的程序，从申购、保管、领用、使用、传代等方面规范化，确保溯源性和稳定性，才能保证菌种资源长期有效的保藏，以便用于日常使用及交流、研究。