朱海霞，王金菊，李 超，王艳萍*

（天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457）

近几十年来，辣椒己成为全世界消费量最大的果蔬之一[1]。千百年来，辣椒泡菜以其脆嫩芳香、酸鲜纯正、解腻开胃促消化的功效吸引着国内外众多消费者[2]。目前，辣椒泡菜主要采用自然乳酸发酵而成，但其发酵时间长，亚硝酸盐含量高，产品质量不稳定，造成其产品无法工业化生产。

乳酸菌是一类可发酵碳水化合物（主要是葡萄糖）产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称[3-4]。乳酸菌作为有益菌群定居在肠道中具有多种保健作用[5]。乳酸菌发酵食品具有提高酸度、改善风味、增加养分、提高营养价值、延长食品保存期、防止腐败、增强人体免疫力等特点[6]。乳酸菌作为功能性发酵剂，已广泛应用于食品行业中，如酸奶、干酪、发酵饮料等[7]。因此，本实验探究将乳酸菌应用于辣椒发酵工艺中的可行性。通过比较不同蔗糖添加量、接种量、食盐添加量，考察辣椒总酸度、感官等变化，优化发酵辣椒的工艺，为辣椒泡菜的大规模工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

辣椒、食盐、蔗糖等均购于当地市场。

菌种：植物乳杆菌299（Lactobacillus plantarum299）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、德氏保加利亚乳杆菌亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus），保藏于天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室。本实验用于辣椒发酵的菌悬液按实验室前期优化后最佳菌种比例进行添加，即将植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、保加利亚乳杆菌以1∶2∶1（v/v）的比例进行添加。

1.2 主要仪器与试剂

市售泡菜坛；HFsafe900型超净工作台：力新仪器上海有限公司；LRH-250生化培养箱：上海柏欣仪器设备厂；TA.XT2i质构分析仪：英国StableMicroSystem公司；DELTA-320 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；LC-20高效液相色谱仪：日本岛津公司。

MRS培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，NaAc 5.0g，柠檬酸二铵2.0g，K2HPO42.0g，MgSO40.2g，MnSO40.05g，Tween-80 1.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 6.2～6.4，121℃高压灭菌20min。

1.3 试验方法

1.3.1 泡菜的制作工艺

1.3.2 操作要点

装坛：按1∶1（w/v）的菜水比例，将水注入坛中，加入乳酸菌菌悬液、食盐、蔗糖充分搅拌溶解后，将辣椒码放于坛中，使其完全浸没于水中。

密封：盖好坛盖，水封坛沿，避免氧气及杂菌进入影响辣椒的发酵。

1.3.3 发酵辣椒单因素试验

分别选取不同的蔗糖添加量、接种量、食盐添加量，按照上述工艺进行发酵，发酵周期为9d，考察上述因素对乳酸菌发酵辣椒的品质的影响。试验因素水平见表1，试验结果表示为3次独立重复实验的平均值。

表1 发酵辣椒试验单因素水平因素Table 1 Factors and levels of the single factor experiment

1.3.4 发酵条件优化正交试验分析

根据1.3.3的试验结果，以感官评分作为评价标准，对蔗糖添加量、接种量、食盐添加量进行正交试验。试验因素水平见表2，感官指标要求及感官评分权重见表3。试验结果表示为3次独立重复试验的平均值。

表2 发酵辣椒正交试验水平因素Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiment

表3 感官指标要求及感官评分权重Table 3 Indicators requirements and evaluation criteria of the sensory

（2）总酸测定

总酸的测定根据GB/T12456-2008《食品中总酸的测定》中的规定，采用滴定法，以乳酸计。

（3）质构分析

将辣椒切成长度1.0cm～1.2cm相同的小块，进行质地剖面分析（texture profile analysis，TPA），试验条件：P/36R探头，预压速率2mm/s，下压速率1mm/s，压后上行速率1mm/s，2次压缩中间停顿5s，试样受压变形为45%，触发力值5g。

（4）有机酸分析[8]

有机酸采用高效液相色谱（HPLC）进行测定与分析。

A.样品的预处理

5g辣椒汁加入到15mL 0.1%（w/v）的磷酸中，4℃条件下7000g离心10 min，取上清过0.45μm的滤膜，备用。

B.色谱条件

液相色谱仪：岛津L710A；色谱柱：Venusil MP C18（5μm，250mm×4.6mm）；柱温25℃，使用0.1%的磷酸作为流动相，流速为1.0mL/min，紫外检测波长210nm，进样量10μL。

C.标准曲线的制作

准确称取有机酸标准品草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酸，溶解于0.1%的磷酸溶液中。分别以不同浓度进样检测，测定不同标准品的出峰时间及其不同浓度对应的峰面积，制作标准曲线。

D.样品测定

将有机酸标准品及预处理后的样品分别进行上机检测，采用外标法计算样品中有机酸的含量。

（5）亚硝酸盐检测

根据GB5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定》中盐酸萘乙二胺法对亚硝酸盐进行测定[9]。

2 结果与分析

2.1 蔗糖添加量对发酵辣椒的影响

在菜水比为1∶1（w/v）、食盐添加量4%，接种量为5%的条件下，向泡菜中分别添加0、2%、4%、6%的蔗糖，于20℃～25℃下发酵9d。考察不同的蔗糖添加量对辣椒发酵过程中总酸度的影响。试验结果见图1。

1.3.5 检测指标

（1）pH检测

直接使用pH计测定辣椒泡菜发酵液的pH值。

图1 蔗糖添加量对总酸含量的影响Fig.1 Effect of sucrose content on total acidity

由图1可以看出，添加蔗糖能加快乳酸菌发酵辣椒产酸的速度，其中2%～6%的添加量之间无太大区别。由于现代泡菜产品向增酸、适甜、低盐的方向发展[10]，在其生产过程中添加适量的蔗糖，不但可以缩短其发酵周期，弥补由于乳酸菌代谢产酸而引起的糖分不足，还可以减轻由强烈酸味所带来的刺激性。但是蔗糖添加量过高，不仅会造成产品生产成本的提高，还会引起产品过高的糖分含量，会影响泡菜的风味并限制了产品的消费人群。因此，综合考虑发酵产酸速度和产品成本，单因素条件下蔗糖的最佳添加量为2%。

2.2 不同的接种量对发酵辣椒的影响

在前期试验结果基础之上，接种量分别选取1%、3%、5%、7%、9%5个水平，考察接种量对辣椒发酵过程中总酸度的影响，结果见图2。

图2 不同接种量对总酸含量的影响Fig.2 Effect of inoculum on total acidity

接种量对发酵速度有较大的影响，接种量较低时，发酵速度缓慢，造成生产周期较长；而随着接种量的增大，发酵速度逐渐增加，生产周期缩短，但过大的接种量会造成对发酵剂的需求量会大大增加，同时由于发酵速度过快，而不利于风味物质的形成[11]。因此，选择合适的接种量，不仅可以缩短发酵周期，也有利于风味物质的形成。由图2可以看出，接种量为7%～9%时，产酸量的差别不明显。因此，单因素条件下最佳接种量为7%。

2.3 食盐添加量对发酵辣椒的影响

在前期实验结果基础之上，将食盐的添加量分别选取为2%、4%、6%、8%，考察食盐添加量对辣椒发酵过程中总酸度的影响。试验结果见图3。

当泡菜发酵中食盐添加量过低时，容易滋生腐败微生物，造成泡菜品质下降，并且影响产品风味[12]；食盐添加量过高时，会对乳酸菌的生长产生抑制作用，造成发酵速度减慢，发酵周期延长[13]。此外，高盐浓度下的泡菜产品的口味也难以被广大消费者接受。由图3可以看出，当食盐质量浓度为2%～4%时，发酵产酸量随盐质量浓度的增加而增加；当食盐质量浓度高于4%时，发酵产酸量随食盐质量浓度的增加而减少，6%的食盐质量浓度已经明显的影响了发酵产酸量。因此，综合考虑发酵速度和产品口感，单因素条件下食盐的最佳添加量为4%。

图3 不同盐质量浓度对总酸含量的影响Fig.3 Effect of salt concentration on total acidity

2.4 正交试验分析确定发酵辣椒的最佳工艺

根据上述单因素试验结果，对发酵辣椒品质有影响的蔗糖添加量、接种量、食盐添加量3个因素进行L9（33）正交试验优化，正交试验设计及结果见表4。

表4 优化辣椒泡菜发酵工艺正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for optimal fermentation

表5 辣椒泡菜正交试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of results of orthogonal experiment

由表4及表5可以看出，影响辣椒泡菜因素的主次顺序为食盐添加量＞蔗糖添加量＞接种量，即3个因素中食盐添加量对辣椒泡菜的影响最大，蔗糖的添加量对辣椒泡菜的影响次之。正交试验优化结果显示，辣椒泡菜最佳发酵工艺为A3B3C2，即蔗糖添加量为3%，接种量为8%，食盐添加量4%。

2.5 辣椒泡菜的理化性质分析

在前期优化发酵工艺基础之上，对发酵辣椒的样品进行理化性质的分析。

（1）pH值和总酸的测定

辣椒样品经pH值和总酸的测定，其pH值为3.23，其酸度为1.20%，均可以达到一个很好的程度，达到人们可以接受的范围，相比较传统自然发酵，大大缩短了达到这一程度所需的发酵时间。

（2）质构分析

图4为最优条件下的接种发酵及传统自然发酵辣椒的TPA试验结果。由图4可以看出在弹性、粘聚性、硬度、胶着度、咀嚼度、回复性、粘着性等方面接种发酵的质构分析结果与自然发酵相似。接种发酵在风味上接近自然发酵，在弹性及回复性上略优于自然发酵。

图4 自然发酵和接种发酵辣椒的TPA试验结果Fig.4 TPA results of natural fermentation and inoculated fermentation

（3）有机酸分析

图5为有机酸标准品的HPLC检测图谱，其中其中峰1为草酸，峰2为甲酸，峰3为苹果酸，峰4为乳酸，峰5为乙酸，峰6为柠檬酸，峰7为琥珀酸，峰8为富马酸，峰9为丙酸。

根据标准品的保留时间与含量标准曲线，测得接种发酵辣椒和自然发酵辣椒中各有机酸的含量见表6。

有机酸是食品酸味的主要来源食品中有机酸的种类、含量与构成对食品的味道有很大影响有机酸不但能够改善食品的风味，还能改变和加强其他风味物质所产生的味感。柠檬酸产生的是一种令人愉快的、兼有清凉感的酸味，但味觉消失迅速；富马酸具有水果酸味；苹果酸产生的是一种特殊愉快的酸味，其酸味的产生和消失都比柠檬酸缓慢；乙酸有较强的刺激味，有强化食欲的功能；琥珀酸兼有海扇和豆酱类的风味；乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的风味[14]。

图5 有机酸标准品高效液相色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of normal organic acids

图6 接种发酵(a)和自然发酵(b)辣椒有机酸高效液相色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of organic acid of inoculation fermented (a) and natural fermented (b) pepper

图6（a）、（b）分别为接种发酵辣椒和自然发酵辣椒有机酸色谱图，对比2个图可以发现，就有机酸种类而言，接种发酵辣椒和自然发酵辣椒无明显差别，说明接种发酵辣椒和自然发酵辣椒在有机酸的组成上非常相似。

根据标准品的保留时间及含量的标准曲线，测得样品接种发酵辣椒与自然发酵辣椒中有机酸相比较，草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸的有机酸含量差别不大。柠檬酸及丙酸的含量接种发酵高于自然发酵，乙酸及富马酸含量接种发酵低于自然发酵，这可能是由于接种发酵与自然发酵相比较，微生物菌群及生物量具有差异性，从而引起了接种发酵与自然发酵辣椒中有机酸含量存在差异。

表6 有机酸分析结果Table 6 Organic acids contents of sample

（5）亚硝酸盐的测定

A.亚硝酸盐标准曲线

亚硝酸盐溶液在波长538nm处的标准曲线方程为y=0.0023x+0.0002，相关系数R2=0.9993。

B.亚硝酸盐含量

根据图7亚硝酸盐标准曲线测得乳酸菌发酵辣椒泡菜的亚硝酸盐含量为5.5mg/kg。亚硝酸盐的含量远低于国家标准GB5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定》中的20mg/kg。自然发酵辣椒泡菜的亚硝酸盐往往会超出国家标准，亚硝酸盐产生的主要原因与硝酸还原酶和杂菌的生长繁殖有关，接种发酵泡菜可以避免杂菌的生长[15]。此外乳酸菌具有一定的亚硝酸盐降解能力，所以亚硝酸盐含量在一个很低的范围。

图7 亚硝酸盐标准曲线Fig.7 The calibration curve of nitrite sodium

3 结论

综上所述，乳酸菌发酵辣椒在菜水比为1∶1的前提下，最佳发酵工艺为蔗糖添加量为3%，接种量为8%，食盐添加量为4%，在20℃～25℃发酵7d～15d。用此方法发酵辣椒，缩短了发酵周期；风味和质地与自然发酵的辣椒泡菜相似；亚硝酸盐的含量远低于国家标准。

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