王金菊，黄 剑，李 超，王艳萍*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

灰树花（Grifola frondasa）又名贝叶多孔菌（polyporus frondosus）。其外观灰白色，如卷心菜大，风味独特，是近年来开发的珍奇食药两用菌之一[1]。灰树花的多种营养素居各种食用菌之首[2]，灰树花具有极高的医疗保健功能。从20世纪80年代开始，国内外学者对其进行了大量研究，从灰树花子实体和菌丝体中提取了几十种活性多糖[3-4]。经过大量的化学和药理药效研究证明，灰树花发酵液中的活性多糖具有明显的抗肿瘤[5]、抗HIV病毒[6]、改善免疫系统[7]、降血脂[8]、降血糖和降胆固醇[9-10]等生物活性，而其抗疲劳的效果鲜见文献报道。

运动耐力实验和生化指标的测定是评价疲劳的2个主要方法，负重游泳实验是运动耐力实验的方法之一，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度[11]。在生化指标的评价中，血清尿素氮（SUN）的含量主要反映机体内蛋白质的代谢情况，机体在长时间运动后就会开始消耗体内蛋白质，从而产生大量的SUN，机体对运动负荷的适应性越低，形成的尿素越多；反之，机体运动后SUN含量越低，表明机体对运动负荷的适应能力强，疲劳的产生就会得到延缓。乳酸脱氢酶（LDH）可以氧化机体血液中的乳酸，从而降低血液中乳酸的含量，使机体回复正常的pH值水平，故LDH活性的增强可以大大加速血液乳酸的清除速率，进而提高机体的抗疲劳能力[12-13]。本研究通过小鼠负重游泳实验、SUN、LDH指标的测定及跑笼实验探究灰树花发酵液的抗疲劳活性，为灰树花发酵液在功能性食品中的应用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

灰树花菌株（Grifola frondosa）由本实验室保存。

1.1.2 实验动物

昆明种小鼠60只，雄性，体质量（20±2）g，中国人民解放军军事医学科学院动物中心提供；许可证号：SCXK-（军）2010-025。动物饲养在天津科技大学清洁级动物实验房完成（环境设施合格证号：SYXK（津）2006-0005）。

1.1.3 试剂与主要仪器

乳酸脱氢酶试剂盒、尿素氮试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；DELTA-320型pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；回转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；7L气升式发酵罐（上海保兴7L）：上海保兴公司；SM-510型全自动灭菌锅：日本YAMATO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 灰树花发酵液的制备

发酵培养基为葡萄糖22g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO40.8g/L；MgSO41.2g/L，115℃高压灭菌30min，将种子发酵液按10%（v/v）接种量接种于发酵培养基中，25℃、140r/min发酵培养14d，抽滤去除菌体，得到灰树花发酵液。将发酵液进行旋蒸，浓缩至固形物含量为4%（w/v）和8%（w/v），分别作为动物实验的低浓度组和高浓度组待试样品。

1.2.2 动物分组与给药

将小鼠随机分为空白组、灰树花发酵液低浓度和高浓度组，每组各12只。样品组分别灌喂0.2mL低浓度和高浓度的发酵液，空白组灌喂相同体积的生理盐水，连续灌喂25d，小鼠正常的饮食和摄水，25d后测定小鼠的体质量。

1.2.3 负重游泳实验

每组选用6只小鼠，末次给予小鼠受试物30min后，置小鼠于游泳箱中游泳，水深为35cm，水温为（25.0±0.5）℃，鼠尾根部负荷5%（w/w）体质量的铅皮。记录小鼠从游泳开始至力竭的时间，作为小鼠游泳力竭时间。

力竭标准：小鼠沉入水面以下8s，无法上浮。

1.2.4 血尿素氮（BUN）和乳酸脱氢酶（LHD）的测定

每组选用6只小鼠，末次给予小鼠受试物30min后，在温度为（30±0.5）℃的水中不负重游泳90min，休息60min后，采血清0.5mL，依照BUN和LHD试剂盒说明书操作。

1.2.5 灰树花发酵液与同类产品的抗疲劳效果比较

将小鼠随机分为空白组、发酵组、佳得乐组（阳性对照）和红牛组（阳性对照），每组各12只。发酵液组灌喂0.2mL发酵液（浓缩至固形物含量为8%），其他各组分别灌以相同体积的生理盐水、佳得乐和红牛，每天灌胃1次，连续25d后测定小鼠体质量、负重游泳试验、BUN和LHD含量，具体测定方法参考1.2.3和1.2.4。

1.2.6 跑笼实验研究抗疲劳效果

将小鼠随机分为空白组、发酵液组、佳得乐组（阳性对照）和红牛组（阳性对照），每组各6只。发酵液组灌胃0.2mL发酵液（浓缩至固形物含量为8%（w/v）），其他各组分别灌以相同体积的生理盐水、佳得乐和红牛，每天灌喂1次，连续25d后，将跑鼠笼置于水槽内使其1/3浸没于水面之下，并使水温控制在（15±2）℃。经过预实验设定小鼠的疲劳阈值为跑笼速度2r/min，当小鼠运动速度低于阈值时，认为其处于疲劳状态。小鼠灌胃后8min跑笼，测定其跑笼速度和跑笼时间。因饮料功效不同，跑笼速度快，持续时间长，可认为该饮料对疲劳小鼠体力恢复的效果好。

1.2.7 数据统计学处理

2 结果与分析

2.1 不同浓度发酵液对小鼠抗疲劳能力的影响

2.1.1 灰树花发酵液对小鼠体质量的影响

表1 灰树花发酵液对小鼠体质量的影响(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

表1 灰树花发酵液对小鼠体质量的影响(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

注：与空白组相比较，“*”表示p＞0.05。

表1显示，3组小鼠灌喂25d后体质量均有增加，但与空白对照组比较，低浓度组和高浓度组在体质量上无显著性差异。表明灰树花发酵液对小鼠体质量增长无显著影响。

2.1.2 对负重游泳力竭时间、BUN及LHD的影响

表2 发酵液对小鼠负重游泳力竭时间、BUN和LHD的影响（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表2 发酵液对小鼠负重游泳力竭时间、BUN和LHD的影响（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

注：与空白组相比较，“*”表示p＜0.05。

从表2可以看出，对于游泳力竭时间，t(高浓度组)＞t(低浓度组)＞t(空白组)，与空白组相比，高浓度组有显著性差异，但低浓度组与空白组相比没有显著性差异。无论从各组的均值还是显著性差异来看，高浓度的灰树花发酵液是有助于延长力竭游泳时间。

通过BUN浓度的比较可以发现，C(高浓度组)＜C(空白组)＜C(低浓度组)，与空白组相比，高浓度组BUN浓度具有显著性差异（p＜0.05）；但低浓度组与空白对照组之间没有显著性差异（p＞0.05），这说明高浓度的灰树花发酵液是有助于缓解蛋白质与氨基酸分解代谢，增强了对负荷的适应性。此外，对于各组小鼠的LHD活力，U(低浓度)＞U(高浓度)＞U(空白组)，低浓度组和高浓度组的LHD活力都很高；与空白组相比，高浓度组和低浓度组都具有显著性差异（p＜0.05），但是高浓度组和低浓度组之间无显著性差异，也就是说，说明灰树花发酵液有助于减少运动后乳酸在肌肉中的堆积，提高小鼠对负荷的适应性，从而缓解疲劳状态。

2.2 发酵液与同类产品的抗疲劳效果比较

2.2.1 各样品对小鼠体质量的影响

表3 发酵液、佳得乐和红牛对小鼠体质量的影响(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

表3 发酵液、佳得乐和红牛对小鼠体质量的影响(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

注：与空白组相比较，“*”表示p＜0.05。

由表3可以看出，4组小鼠给药25d后体质量均有增加，与空白组相比，发酵液组和阳性组都无显著性差异，表明发酵液组、佳得乐和红牛对体质量无显著影响（p＞0.05）。

2.2.2 对负重游泳力竭时间、BUN及LHD的影响

表4 发酵液、佳得乐和红牛对小鼠负重游泳时间、BUN和LHD的影响（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表4 发酵液、佳得乐和红牛对小鼠负重游泳时间、BUN和LHD的影响（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

由表4可以看出，对于各组小鼠的力竭游泳时间，t(红牛组)＞t(发酵液组)＞t(空白组)＞t(佳得乐)，与空白组和佳得乐组相比，发酵液组和红牛组都具有极显著性差异（p＜0.01），虽然发酵液组与红牛组相比游泳时间更长，但两组之间并无显著性差异。

通过BUN浓度的比较可以发现，C(发酵液组)＜C(佳得乐)＜C(红牛组)＜C(空白组)，与空白组相比，发酵液组、佳得乐组和红牛组都具有显著性差异（p＜0.05），但是该3组之间并无显著性差异。综上所述，灰树花发酵液具有同佳得乐和红牛相似的抗疲劳效果，但是该指标结果不能证明发酵液比同类产品要更好。

此外，对于各组小鼠的LHD活力，U(发酵液组)＞U(佳得乐)＞U(红牛组)＞U(空白组)，即发酵液组的LDH活力均值最高，但各组之间无无显著性差异（p＞0.05）。究其原因，可能是组内差异要大于组间差异，即组内所测得的LDH活力差异性过大。造成这种现象的可能原因是在实验过程中，由于冬季气温较低，少数对温度敏感的小鼠，提早出现疲劳和力竭状态；而相对耐寒的小鼠则更容易适应本次实验，这样最终造成了组内的差异远超过组间的差异，进而无法通过方差分析得出组间的显著性差异。

2.3 跑笼实验结果

2.3.1 对小鼠跑笼时间和速度的影响

表5 发酵液、佳得乐和红牛对小鼠跑笼时间和速度的影响（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

表5 发酵液、佳得乐和红牛对小鼠跑笼时间和速度的影响（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

注：与空白组相比较，“*”表示p＜0.05。

由表5可以看出，对于跑笼事件t(发酵液组)＞t(佳得乐组)＞t(红牛组)＞t(空白组)，即发酵液组小鼠在冷水中跑笼时间最长。与空白组相比，发酵液组存在显著性差异；但是与阳性对照组（佳得乐和红牛组）相比，则无显著性差异。

通过对各组小鼠跑笼速度的分析可以看出，虽然V(发酵液组)＞V(佳得乐组)＞V(红牛组)＞V(空白组)，但各组之间并无显著性差异。这可能是由于组内差异大于组间差异[14]所造成的，即组内差异性远大于组间差异性，从进而各组之间的差异不存在显著性。

2.3.2 对小鼠每分钟内跑笼圈数的对比分析

表6 各组小鼠每分钟内跑笼圈数（圈）随时间的变化Table 6 Change of the lap number per minute with time

由表6和附图可知，发酵液组小鼠在整个跑笼过程中，跑笼时间最长而且整体速度比其他3组更快，并且在较短时间内达速度峰值（第4min时达最大速度6.30r/min），这间接的反应了实验组能小鼠能快速适应强度较大的运动。而佳得乐组小鼠跑笼速度和红牛组小鼠在整体水平上较为接近，跑笼时间也仅仅比红牛组多1min。从总体趋势来看，空白组和佳得乐组的跑笼速度上下波动较大，可能是由于个体差异性太大引起的，个别小鼠能快速适应低水温，有的则不然。

图1 各组小鼠每分钟内跑笼圈数随时间的变化Fig.1 Change of the lap number per minute with time

3 结论

（1）与阳性对照组相比较，灰树花发酵液（浓缩至固形物含量为8%（w/w））具有相似的抗疲劳效果。

（2）与空白组相比较，灰树花发酵液在提高体能，缓解疲劳方面具有显著性的效果，具有开发成为抗疲劳食品的潜力。

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