高效酒精酵母菌选育及其特性研究

2013-04-23罗跃中李忠英李继睿吴永尧

中国酿造 2013年8期

罗跃中，李忠英，李继睿，吴永尧

（1.湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004；2.湖南农业大学生命科学院，湖南长沙 410128）

随着全球石油能源的日趋枯竭及环境污染的加剧，开发新的绿色能源势在必行，燃料酒精替代汽油能源将逐渐成为发展趋势[1-2]。目前，燃料酒精生产多采用微生物发酵方式。生产酒精的菌种以酵母菌为主，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和品质。在酒精发酵时，产生的高浓度酒精和相对较高的发酵温度对产酒率影响较大，高浓度酒精会限制酵母菌的生长繁殖，对酒精发酵产生强烈的抑制作用；与此同时，受季节变化和发酵过程放热使温度不断升高也会限制酵母的发酵。酵母发酵适宜温度是30℃～33℃，一般不超过36℃，温度过高，会导致酵母老化和死亡，使发酵过程不能正常进行，酒精得率降低。而耐高温酵母能减少生产中由于降温所带来的麻烦和费用。因此，高产酒精酵母的选育和发酵工艺的改进是实现酒精浓醪发酵工业化生产的关键[3-6]。

本研究从自然界中筛选分离出具有较强温度和酒精耐受性的酵母菌株，经紫外线和亚硝酸诱变得到一株高产突变株UV-N-5，提高了其产酒精能力，同时也对其生理特性进行研究，旨在筛选培育适用于酒精工业发酵的新菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌样来源

各种腐败水果、葡萄园里土壤、湘天桥菜市场甜酒醪、湘乡燕京啤酒厂酒醪、学生食堂下污水及实验室教学用酵母菌等。

1.1.2 主要培养基

富集培养基：含10%vol酒精麦芽汁（8°Bx）、含14%vol酒精麦芽汁（10°Bx）。

分离驯化培养基：麦芽汁（8°Bx）及酵母蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，若制备YPD固体培养基，加入2%琼脂粉。

筛选培养基：TTC上层培养基为TTC 0.05g，葡萄糖0.5g，水1L；TTC下层培养基为YPD琼脂。

种子培养基：葡萄糖1.0g/L，KCl1.5g/L，酵母浸膏2.5g/L，醋酸钠8.0g/L。

酒精发酵培养基：葡萄糖5g/L，玉米浆20g/L，尿素2g/L。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外分光光度计：日本岛津公司；XB124-S电子天平：梅特勒电子仪器有限公司；超净工作台：江苏净化设备厂；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械；HPS-250生化培养箱：哈尔滨市东明科技有限公司；QYC-21全温空气摇床：上海福玛实验设备有限公司；S2617R显微镜：江南光电股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

将采集的样品加无菌水振荡1h，打碎菌胶团，释放游离菌备用。

1.3.2 富集培养

在振荡处理后的菌悬液中取5mL，分别加入至已灭菌的酒精度为10%vol的培养基中，40℃培养24h，再转入酒精度为14%vol的培养基中，45℃培养24h，镜检。配制成合适的菌悬液并取lmL接入YPD固体平皿中，45℃培养2d～3d，经镜检为纯种后分别转入YPD固体斜面，冰箱保存。

1.3.3 酵母菌的筛选

TTC法[7-8]：将分离得到的各菌株活化后依次接入TTC下层培养基的平皿中，培养24h，长出菌落后倒入TTC上层培养基，40℃保温（阴暗处）2h～3h，成深红色菌落，将酵母菌接种于YPD固体培养基中，长出菌落后再接种于麦芽汁培养基中增菌使活菌浓度达到107个/mL，然后取6mL装入300mL带滤芯的发酵瓶中，加入200mL麦芽汁于40℃培养48h，每日称重，记录每日失重情况，待发酵结束时计算总失重，并对发酵液成分进行分析（可溶性固形物、酒精度、还原糖）。试验重复3次，复筛得到性状最为优良的菌株。

1.3.4 紫外线及亚硝酸复合诱变方法

参照刘庆玉等[9]实验方法进行，菌悬液先用30W紫外线照射处理60s，然后再用浓度为0.2mol/L的亚硝酸处理20min，诱变菌株经培养后，挑取菌落较大且厚的菌株，编号并接入试管斜面保藏，同时取对应的菌株活化后接种至250mL摇瓶中，30℃、180r/min摇床发酵培养48h，对发酵液进行分析并选取优势菌株。

1.3.5 还原糖的测定

采用DNS法测定[10]。

1.3.6 酒精度的测定

取100mL成熟发酵醪，加入100mL蒸馏水，蒸馏出100mL液体，摇匀后用酒精计和温度计分别测定其酒精度和温度，然后查表校正为20℃时的酒精度[11]。

1.3.7 优势菌株生理特性研究

生长曲线的测定：将筛选出的酵母接种到YPD培养基中，在一定温度条件下180r/min恒温摇床培养，每隔2h取一次样。用分光光度计在波长660nm处，以蒸馏水作空白，测定培养液的OD值。

耐酒精特性：杜氏小管注满培养基后倒置于盛满麦芽汁的试管中。灭菌后加入不等量的无水乙醇，制成不同的浓度梯度，接种待测菌株于30℃的条件下培养。10h后测定细胞死亡率。

耐酸碱特性：将酵母种子液接入不同pH值的YPD培养基中，最适生长温度条件下恒温培养24h，于波长660nm处测定OD值，确定在不同pH值下的生长情况。

耐高温特性：将酵母种子液接入YPD培养基中，不同温度恒温培养24h，于波长660nm处测定OD值，确定在不同温度条件下的生长情况。

耐糖性：制备葡萄糖含量分别为10%、20%、35%、40%、50%、60%（w/v）的麦芽汁，灭菌后分别接种酵母菌，35℃培养24h，于波长660nm处测定OD值，判断菌株对渗透压的耐受性。

遗传稳定性实验：对经过紫外线和亚硝酸诱变筛选出的产酒精能力最高的优势菌株，进行连续5代传代培养后测定其产酒率，考察优势菌株的遗传稳定性。

2 结果分析

2.1 酵母菌的筛选

本实验将采集的样品置于含10%vol乙醇的培养基中，使在含高浓度酒精培养基条件下不生长的菌株被淘汰掉，而能适应的菌株被保留下来，富集及驯化培养的主要目的是使目标菌株能够适应其生长环境并旺盛生长。TTC是一种显色剂，对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过其可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低[12]。颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。经过筛选共得到8株产气较高酵母菌，结果见表1。

表1 TTC筛选酵母结果Table 1 Results of yeast screened by TTC

由表1可看出，TJ-18号酵母产酒精能力较强，达到5.90%vol；残还原糖约为1.00%，糖利用率较高，且发酵力突出，培养48h，CO2失重为10.4g。故将TJ-18菌作为后续实验初始菌株。

2.2 紫外线诱变筛选结果

按1.3.4实验方法，菌悬液先用30W紫外线照射处理60s，培养后选取大且厚菌落，分别标识为UV1～UV10，并同时接种及发酵培养。紫外诱变的结果（表2）可知，经过诱变后，UV-1、UV-6产酒精能力有所减弱，而其他大部分菌株的产酒精能力得到了提升，如UV-2、UV-8、UV-10等菌株酒精产量达到7.00%vol左右，其中UV-8菌株产量最高，达到7.02%vol，相对于出发菌株TJ-18提高了19.0%。紫外线是常用的物理诱变因子，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。UV诱变主要是通过使DNA分子形成嘧啶二聚体，影响碱基配对与正常解链，造成基因的突变或死亡，从而提高产酒精能力[13]。

表2 TJ-18菌株紫外诱变后结果Table 2 Results of ultraviolet mutation of TJ-18 strain

2.3 亚硝酸诱变筛选结果

对菌株UV-8再进行亚硝酸诱变处理，由表3可知，经亚硝酸诱变后，酒精的产量进一步提高，主要是紫外线与亚硝酸有较好的协同性。其中菌株UV-N-5的酒精度为8.25%vol，相对于UV-8提高了17.5%，即为本实验得到的目的菌株。

表3 UV-8菌株经亚硝酸诱变后结果Table 3 Results of nitrite mutation of UV-8 strain

2.4 优势菌株UV-N-5的生理特性研究

2.4.1 生长曲线的测定

通过微生物生长曲线可以了解优势降解菌UV-N-5生长繁殖规律。其反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。从图1可以看出，在0～2h没有表现出明显的停滞期，各个温度下都有不同程度的生长。从4h～10h进入对数生长期，12h后达到稳定期。

图1 菌种UV-N-5生长曲线Fig.1 Growth curve of strain UV-N-5

2.4.2 耐酒精特性

过高的酒精浓度对酵母有毒性，会抑制细胞的生长及发酵活性。所以，酵母的发酵能力在很大程度上取决于其自身酒精耐受力的大小[14]。酵母菌UV-N-5在麦芽汁中培养，培养温度为30℃，接种量为1×107个/L，培养时间为10h，测定菌株的死亡率。由图2可知，在酒精度为20%vol、16%vol、12%vol时，UV-N-5的死亡率分别为50%、43%和34%。在酒精度为8%vol、4%vol，死亡率分别为11%和6%。说明UV-8能耐较高浓度的酒精。可能与其从甜酒糟中筛选出来的有关，这一点从生产上来说是有利的。

图2 菌种UV-N-5耐酒精特性Fig.2 Alcohol resistant characteristics of strain UV-N-5

2.4.3 耐酸碱特性

图3 菌株UV-N-5耐酸碱特性Fig.3 Acid and alkali resistant characteristics of strain UV-N-5

耐酸碱实验结果（图3）表明，UV-N-5菌能在pH值为3.0～9.0的范围内正常生长，在pH值为4.5～6.0的范围内生长旺盛，而这也正是实际生产中的正常pH值范围，说明了UV-N-5菌可用于实际生产应用。

2.4.4 耐高温特性

菌株UV-N-5耐高温实验结果（图4）可知，当发酵温度达到35℃时，该菌的生长状态达到最佳，之后随着温度的升高而降低。但是该菌在温度40℃时仍保持出很好的耐受性，说明本实验筛选出的酵母菌的耐热性忧于之前筛出的菌株。但发酵温度高于40℃时，该菌的发酵力显著下降，可能是因为高温使细胞内酶活降低，细胞膜结构和流动性发生变化，引起酵母早衰、死亡，故高温对酵母菌的生长和发酵产气是不利的[15]。

图4 菌株UV-N-5耐温特性Fig.4 Temperature resistance characteristic of strain UV-N-5

2.4.5 不同糖质量浓度对UV-N-5生长影响

菌株UV-N-5在不同糖质量浓度中生长情况见图5，UVN-5在低浓度的葡萄糖中都能较好生长，当糖质量浓度＞10%，酵母菌的生长明显受到抑制，随糖质量浓度的增加而抑制酵母菌的增殖。这可能是由于糖质量浓度过高造成渗透压的增大抑制了酵母菌的增殖。而提高初始糖质量浓度可以提高发酵醪的酒精含量，因此生产用的母菌都需要有一定的渗透压的耐受能力。从图5可以看出，当初始糖质量浓度达到40%时，UV-N-5菌的生长变得缓慢。

图5 不同糖质量浓度对菌种UV-N-5生长影响Fig.5 Effect of different sugar concentration on strain UV-N-5 growth

2.4.6 菌株UV-N-5传代稳定性研究

对优势菌株UV-N-5进行连续5次传代实验，测定其产酒精能力，由表4可知，发酵后平均产酒精度维持在8.20%vol左右。表现出较好的传代稳定性。

表4 菌株UV-N-5传代稳定性实验结果Table 4 Results of strain UV-N-5 genetic stability test

3 结论

本研究从自然界中分离得到的一株优良的酒精生产菌株TJ-18，发酵酒精度达到5.90%vol，表现出较强的发酵产酒精能力。通过紫外诱变对其进行了改造，其中UV-8菌株产酒精量最高，达到7.02%vol，相对于出发菌株TJ-18提高19.0%。再以UV-8菌株为出发菌株，经亚硝酸诱变后发酵能力进一步提高。使其发酵后的酒精度达到了8.25%vol，比初始菌株TJ-18提高39.83%。同时对优势菌株UV-N-5进行5次传代实验，其产酒精相对稳定，说明其遗传稳定性较好。

微生物菌种质量的好坏对发酵工业有及其重要的影响，这一研究的技术关键在于获得耐高渗透压且酒精发酵速率快、耐酒精和耐高温的酵母菌种，这也是目前研究热点。通过对复合诱变筛选后UV-N-5菌的生理特性研究，发现在实验过程中该菌表现出较好的耐高温、耐糖性及耐酒精特性，但是对具体适合该菌株的培养基质和培养条件有待在后续实验进一步研究，为其以后作为工业菌应用奠定基础。

[1]刘畅，王涛，石翠芳.耐高温酵母菌的筛选及特性研究[J].酿酒，2007，34（2）：52-53.

[2]刘海臣，张敏楠，阮时雷，等.多样品耐高温产乙醇酵母的筛选及生长特性研究[J].食品科技，2008（3）：18-19.

[3]陈思耘，萧熙佩.酵母生物化学[M].济南：山东科学技术出版社，1990.

[4]秦成国.玉米粉高浓度酒精发酵的研究[J].酿酒科技，1997（4）：52-54.

[5]毛志群，张伟，檀建新，等.燃料乙醇用高产酒精酵母的筛选及鉴定[J].酿酒，2003，30（3）：35-36.

[6]KREGER NYW.The yeasts:A taxonomic study[M].Third revised and enlarged edition.Netherlands:Elsevier sciencepublishers B.V.，1984.

[7]中国科学院微生物研究所.常见与常用真菌[M].北京：科学出版社，1973.

[8]王梅，张澎湃，帅桂兰，等.TTC 在黄酒酵母选育中的应用[J].酿酒，2001，28（5）：62-64.

[9]刘庆玉，姚影，张敏，等.紫外诱变筛选高效木质素降解菌株的研究[J].可再生能源，2010，8（28）：58-59.

[10]许安邦，林维.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，2002.

[11]章克昌.酒精与蒸馏酒工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，2004.

[12]董博宇，陈叶福，岳瑞雪，等.TTC 在发酵木糖高产乙醇的休哈塔假丝酵母选育中的应用[J].酿酒科技，2008（10）：40-43.