廖玲敏 潘锐柯 周力学薛淑娟 张莘 周楠 狄娜

中山大学孙逸仙纪念医院妇产科，广东 广州 510120

近年来随着超声造影剂制备技术的不断改进，靶向超声微泡造影剂（targeted microbubble contrast agents, TMCA）在疾病诊断和治疗中的作用成为一个研究热点。经静脉注入带有特定配体的靶向微泡造影剂，在体内通过配体与受体结合的方式，使微泡选择性聚集并较长时间停留于靶组织或靶器官而达到靶向显影[1]。目前国内外已有多篇关于TMCA应用于各种肿瘤早期诊断的报道[2-3]。有研究证实，在体外靶向微泡与绒毛膜癌细胞可特异性结合，流其结合力具有一定的强度，有望能抵抗毛细血管内血流生理性冲洗的破坏，实现靶向显影[4-6]。本研究旨在探讨耦合抗人绒毛膜促性腺素（anti-human chorionic gonadotropin beta，β-HCG）抗体TMCA的稳定性及靶向微泡与妊娠绒毛组织在体外的结合特性，为今后滋养细胞肿瘤的早期诊断、准确定位及评估化疗疗效提供更为准确和科学的依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

实验组选自中山大学孙逸仙纪念医院妇产科2010年3月—2011年2月进行门诊人工流产术患者的妊娠绒毛组织。患者年龄20～36岁，妊娠时间均在6～7周，平时月经规律，无内分泌紊乱、自然流产、习惯性流产、稽留流产史等。

对照组选同期本科室收治的宫颈癌行全子宫切除术患者的内膜组织，患者年龄均＜40岁，月经规律，有生育史，临床和病理排除子宫内膜癌、子宫内膜增生症、子宫内膜息肉、子宫黏膜下肌瘤等。

本实验得到本院生殖医学伦理委员会的批准，并获得患者知情同意。

1.2 材料和仪器

声诺维（SonoVue）由瑞士BRACCO Imaging BV公司生产；鼠抗β-HCG、荧光素标记兔抗小鼠IgG（rabbit anti-mouse IgG/FITC）和兔抗鼠IgG血清，购于北京博奥森生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC），购于美国SIGMA公司；倒置荧光显微镜；FACS Calibur流式细胞仪。

声诺维混悬液：冻干粉[聚乙二醇4000、二硬脂磷酰脂胆碱（DSPC）、二棕榈磷酰脂甘油（DPPGNA）、棕榈酸]25 mg和SF6气体59 mg缓慢加入到0.9%NaCl溶液5 mL，静置备用。使用期间应密封，避免气体弥散。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集、保存及处理取人流室做负压吸引术获取的新鲜妊娠绒毛组织和在开腹或经阴式全子宫切除术获取的子宫内膜组织，立即由本院病理科做快速冷冻切片。取1张用苏木素-伊红染色，由病理科医生阅片证实为正常妊娠绒毛组织。切片后立即保存于-29℃冰箱中，当日使用完毕。

1.3.2 靶向微泡造影剂的制备与鉴定 TMCA的制备按参考文献方法进行[4,7]。玻片凝集试验：取4张洁净载玻片A、B、C、D，其中A、B载玻片分别加20 μL靶向微泡造影剂，C、D载玻片上加20 μL 声诺维。然后，A、C载玻片上分别滴加等容积兔抗鼠IgG血清，B、D载玻片上分别滴加等容积的0.9%NaCl溶液。不时摇动，光镜下观察。免疫荧光实验：取制备好的TMCA和声诺维混悬液各50 μL，分别加入等容积FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体稀释液，避光反应15 min，在荧光显微镜下观察。

1.3.3 靶向微泡造影剂稳定性的检测取FITC标记兔抗鼠IgG抗体稀释液100 μL，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS以1∶20稀释；稀释后加入上述制备好的TMCA 2 mL混合后，振荡混匀，避光反应10 min，用PBS洗涤混悬液，去除游离抗体。用500μL TMCA＋500 μL PBS作为空白对照组。在流式细胞仪上进行检测，分别检测1、10 、20 及30 min各时间点声诺维混悬液和抗β-HCG抗体的结合率，观察普通微泡与抗体结合率随时间变化的情况。重复检测17个样本。

1.3.4 靶向微泡造影剂与绒毛组织切片的寻靶实验将妊娠绒毛组织冷冻切片随机分为TMCA组（A组）和声诺维组（B组），每组各10张切片，分别与TMCA、声诺维混悬液进行结合实验；将正常子宫内膜组织冷冻切片随机分为TMCA(C组）和声诺维组（D组），每组各10张切片，分别与TMCA、声诺维悬混液进行结合反应。在显微镜下观察微泡与绒毛组织结合情况，以每个绒毛组织上结合20个以上微泡为阳性，每张切片随机观察6个不同的绒毛组织，以子宫内膜组织为对照组。

观察5 min后，用新配制的PBS反复冲洗绒毛组织切片上的TMCA，然后在显微镜下观察TMCA微泡与绒毛组织结合情况，比较冲洗前后TMCA微泡与绒毛组织结合率来评价结合的稳定性。

抗体阻断实验的过程：取绒毛组织冷冻切片，复温20 min，PBS冲洗3次后；在切片上滴加100 μL 鼠抗β-HCG稀释液，37℃温育5 min，用PBS冲洗去除未结合的游离抗体；再加入TMCA 100 μL，37 ℃温育5 min；用PBS洗涤后，计数绒毛组织与TMCA的结合情况；以子宫内膜组织为对照。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 靶向微泡造影剂的鉴定结果

本实验中制备的TMCA为乳白色混悬液，光镜下观察，微泡大小、分布均匀，与普通声诺维微泡无异。当加入兔抗鼠IgG抗血清后，光镜下观察原来均匀分布的TMCA形成轻度凝集状态，微泡之间连成串状形如葡萄。而加0.9%NaCl溶液后仍是均匀分散的微气泡。声诺维加入兔抗鼠抗血清或0.9%NaCl溶液后均未见凝集反应。经FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体稀释液染色后，荧光显微镜下观察可见TMCA壳表面发出环状明亮的的绿色荧光，而单纯的声诺维微泡表面则未见荧光。

2.2 流式细胞仪检测结果

声诺维微泡与鼠抗β-H C G的结合率在1 、10 、20 及30 min分别为（92.25±2.18）%、（93.59±4.46）%、（95.27±2.88）%、（95.80±1.50）%，其结合率随时间的增加越来越高。其中1 min时的结合率分别与20、30 min的结合率相比，差异有统计学意义（P＜0.05），10 和30 min的结合率差异有统计学意义（P＜0.05），而其他几个时间点的差异无统计学意义（图1）。

2.3 靶向微泡造影剂与绒毛组织切片的寻靶实验结果

图1 抗体与微泡结合率A：1 min；B：10 min；C：20 min；D：30 min

图2 声诺维与绒毛组织、子宫内膜组织结合率（×200）A：TMCA与绒毛组织结合；B：SonoVue与绒毛组织结合；C：声诺维与子宫内膜组织结合；D：声诺维与子宫内膜组织结合

TMCA与妊娠绒毛组织温育5 min后，在光镜下观察可见大量TMCA聚集在绒毛滋养层细胞周围（图2A），仅少量的声诺维微泡散在结合于绒毛组织切片上（图2B）；而对照组子宫内膜组织仅少量的TMCA或声诺维微泡散在结合于组织间隙（图2C、D）。TMCA与绒毛组织和子宫内膜组织结合的阳性率分别为（83.30±2.15）%（13.30±2.58）%，两组相比差异有显著的统计学意义（P＜0.01）；声诺维与绒毛组织和子宫内膜组织结合率分别为（15.00±3.07）%和（8.30±1.48）%，两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；TMCA与绒毛组织结合率和声诺维与绒毛组织结合率相比，其差异有显著统计学意义（P＜0.01）；T M C A和子宫内膜组织结合率与声诺维和内膜组织结合率相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

TMCA与绒毛组织冲洗前后的结合率：TMCA与绒毛组织反应5 min后，显微镜下观察到微泡大部分聚集在绒毛滋养层细胞周围，而组织切片的中间胚芽组织部分少见微泡聚集。冲洗之前结合率为（83.30±2.15）%，用PBS匀速冲洗后，有部分微泡被冲走，结合率为（78.30±4.36）%，冲洗前后结合率相比差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组子宫内膜组分别冲洗前后的结合率分别为（13.30±2.58）%和（5.00±1.10）%，冲洗前后结合率相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

当使用抗β-HCG抗体预处理绒毛组织和子宫内膜组织后，TMCA与子宫绒毛组织的结合率为（16.70±2.50）%，TMCA与子宫内膜组织的结合率为(11.70±2.47)%。抗体预处理绒毛组织前后结合率相比，差异有显著的统计学意义（P＜0.01），抗体预处理子宫内膜组织前后结合率相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

TMCA的应用是进行超声分子显像的物质基础，而制备靶向微泡的关键技术在于微泡的表面修饰，即如何将特异度好、活性高的配体牢固结合到微泡表面。本实验采用聚乙二醇4000作为耦联剂增强微泡和配体的连接。聚乙二醇具有良好的柔韧性和延展性，可向外伸入周围介质中数十纳米，提高了靶向作用的稳定性；同时，浓密的短多聚链层也可保证微泡的稳定性，降低其非特异性结合率[8]。本实验所选用的声诺维超声造影剂外有稳定的磷脂外壳，内含SF6气体。脂质体（磷脂）以单层形式包裹微气泡，分子的疏水端朝向气体，亲水端朝向水溶液介质，形成一道坚固的屏障，有效地避免了溶液中微泡间的相互融合[9]。由于单克隆抗体不能耐受微泡的制备过程，所以在本实验制备TMCA的过程中直接将声诺维混悬液和抗β－HCG抗体溶液等容积结合，4 ℃条件下静置；利用含气体微泡比周围的水相轻的特点，2 h后，上层为混悬液，下层为清亮液体，经新配制的PBS悬浮3次后，所得上层混悬液，用玻片凝集实验、免疫荧光染色实验进行鉴定，均证明了抗β－HCG抗体可以结合声诺维至混悬微泡表面，并且其结合率不随时间的延长而明显降低。此种方法成本低，操作简单，实验条件要求不高，不影响微泡和抗体活性，不会对微泡造成破坏，能满足靶向超声造影剂的早期实验研究。

妊娠滋养细胞疾病是一组来源于胎盘绒毛滋养细胞的疾病，具高度恶性，早期可通过血行转移至全身，因而早期定位诊断恶性滋养细胞肿瘤尤为重要。普通超声微泡造影剂因缺乏对病变组织的特殊亲和力，不能有效驻留靶组织，不利于观察微小病变，从而有可能错过早期发现滋养细胞侵袭血管的证据。TMCA对于靶区病变有一定的亲和力，可以到达靶向区域组织或器官，选择性地与相应的配体结合，从而达到特异的增强靶区超声信号。本实验中将抗β－HCG抗体连接到声诺维的外壳上制备成TMCA，通过与妊娠绒毛组织的结合反应、子宫内膜组织对照组实验及抗体预处理实验，表明耦合抗β-HCG抗体的TMCA与绒毛组织在体外一定条件下能高效率、高强度，高特异性地结合。

因临床上早期发现恶性滋养细胞疾病大多经化疗后能治愈，所以很难取得子宫的大体标本；而肿瘤滋养细胞和正常妊娠的滋养细胞在许多方面仍保持不少相似之处，如都能产生HCG等糖蛋白和性激素，所以本试验选取人工流产术后的妊娠绒毛组织作为研究对象。本实验不足之处为所制备的TMCA在体外能与绒毛组织特异性的结合，但在实际应用中抗体介导的靶向微泡会受到血流剪切状态的限制，大部分抗体在高剪切力的血流中不能迅速地与配体结合[10]。因此究竟在体内靶向造影剂对靶器官的作用如何，还需深入研究。

[1]KLIBANOVAL.Ligand-carryinggas-filled microbubbles:ultrasoundcontrast agents for targeted molecular imaging [J].Bioconjug Chem, 2005, 16(1):9-17.

[2]WELLER G E, WONG M K, MODZELEWSKI R A,et al.Ultrasonicimaging of tumor angiogenesis using contrast microbubbles targeted via the tumor-binding peptide arginine-arginine-leucine [J].Cancer Res, 2005,65(2): 533-539.

[3]卞爱娜, 高云华, 谭开彬, 等.免疫脂质体微泡造影剂的制备及体外靶向研究[J].中国医学影像技术, 2001,20(3): 356-358.

[4]周力学, 朱军, 丁红, 等.绒癌细胞靶向微泡造影剂结合特性研究[J].南方医科大学学报, 2007, 27(11): 1706-1709.

[5]周力学, 李艳,贾彩霞, 等.JAR细胞靶向微泡造影剂的体外研究 [J].中国超声医学杂志, 2007, 23(5): 324-326.

[6]周力学, 丁红,贾彩霞, 等.SonoVue微泡瞬时均一性对新型绒癌细胞靶向造影剂结合特性的影像[J].癌症,2008, 27(7): 692-697.

[7]KLIBANOV AL.Targeteddeliveryof gas-filled microspheres, contrast agents for ultrasound imaging [J].Adv Drug Deliv Rev, 1999, 37(1-3): 139-157.

[8]JEPPESEN C, WONG J Y, KUHL T L, et al.Impact of polymer tether length on multiple ligand-receptor bond formation [J].Science, 2001, 293(5529): 465-468.

[9]夏红梅, 高云华.靶向超声造影剂的制备及应用研究进展 [J].中华超声影像学杂志, 2004, 13(3): 224-226.

[10]冉海涛.靶向超声造影显像研究现状与进展 [J].中华医学超声杂志(电子版), 2011, 8(5): 929-933.