迟春萍，时成波，曹玉锋，陈子杨，徐 军，张健锋，贾 媛，李 铮，王小杰，牛 灵，田海山，孙 彪，李校堃,*

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.长春生物制品研究所，吉林 长春 130062；3.中国科学院 微生物研究所，北京 100080；4.四平华科生物技术有限责任公司，吉林 四平 136000)

构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究

迟春萍1,2，时成波2，曹玉锋2，陈子杨2，徐 军2，张健锋2，贾 媛2，李 铮2，王小杰1，牛 灵3，田海山1，孙 彪4，李校堃1,*

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.长春生物制品研究所，吉林 长春 130062；3.中国科学院 微生物研究所，北京 100080；4.四平华科生物技术有限责任公司，吉林 四平 136000)

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成，与pPIC9K连接，构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体，通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子，获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定，基因拷贝数提高2～8倍，活性检测显示提高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关；表达产物为二聚体，其分子质量为40kD左右，低糖基化，均为分泌表达。Western blot法分析，对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期，24h后进入生长稳定期；转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定；Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件，经诱导表达，Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好，表明构建了高表达菌株。……