王 群，郑小龙，朱来华，肖西志，邓明俊，岳志芹，孙 涛，赵玉然

（山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002）

马媾疫（Dourine）是由锥虫属（Trypanosoma）的马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）寄生于马属动物的生殖器官所引起一种寄生虫性传染病。该病不同于其他锥虫病，可通过感染马与健马交配传染[1]。

目前，国内对于媾疫锥虫病的诊断主要是通过病原学和血清学检测两种方法。病原学诊断虽然可以确诊，但费时费力，而且检出率低[2]。血清学诊断中ELISA基本上是全虫提取抗原，特异性较差；补体结合试验操作繁琐耗时，而且影响因素过多，判定比较困难。研究显示，锥虫不同亚种虫株的基因组中存在某些差异[3-4]。本研究利用锥虫基因组中存在的差异，通过荧光定量PCR技术建立了一种特异的、快速的媾疫锥虫检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和虫株 马鼻肺炎病毒（Equid herpesvirus，EHV）、马动脉炎病毒（Equine arteritis virus， EAV）和 马 流 感 病 毒 （Equine influenza virus，EIV）由本实验室保存；马媾疫锥虫美国株基因组、伊氏锥虫美国株基因组和马焦虫德克萨斯株基因组由本实验室保存。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒、ExTaqPCR试剂盒、连接试剂盒、DH5a、pMD18-T、DNA Marker DL2000和AMV反转录酶均购自TaKaRa公司；Power SYBRRGreen PCR Master Mix购自ABI公司；PureLink Micro-to-M idi Total RNA Purification System购自Invitrogen公司。

1.3 引物设计 根据GenBank登录的马媾疫锥虫Maxicircle DNA基因序列（EU185800.1），参照文献[3]的报道，选择其保守区域，利用Primer primer5.0软件设计一对基因片段克隆引物，D1-F：5'-TGGGTTTATATCAGGTTCATTTATG-3'和 D1-R：5'-CCCTAATAATCTCATCCGCAGTACG-3'。

选取保守区域设计荧光定量PCR的引物，P1：5'-TGTTTTATAGTATTTTACGCA-3'和 P2：5'-ATCT CATCCGCAGTACGCTGT-3'，扩增长度为 151 bp，由TaKaRa公司合成。

1.4 病毒DNA和RNA的提取及其cDNA的制备各取病毒液100μL，按照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，-20℃保存备用。

取病毒液100μL按照试剂盒的说明书提取病毒RNA，用AMV反转录酶按照说明书反转录合成cDNA。……