杨培培，王 颖，胡继明，杨瑞梅，张传美，韩先杰，黄 娟，孙月平，秦晓冰，单 虎

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）也称绿脓杆菌（Bacillus pyocyaners），是一种条件致病菌，该菌广泛存在于自然环境中、人和动物的肠道、皮肤[1]。近年来，由PA引起的动物疫病有上升趋势，我国山东省是水貂养殖大省，不断有养殖场出现大规模PA原发病的报道，给水貂养殖户造成严重的经济损失[2]。临床证明，该菌对大多数防腐剂和抗菌药物表现为天然或获得性多重耐药，所致感染可供选择的有效抗菌药物很少，困扰着临床PA病的治疗[3]。因此，预防PA的感染尤为重要。

PA的鞭毛蛋白能够与粘蛋白、糖脂脱唾液酸以及Toll样受体5结合而诱导炎症反应，在连接天然免疫应答和获得性免疫应答中起重要作用，显示PA鞭毛蛋白具有良好的免疫原性[4-6]。鞭毛蛋白基因（flic）编码的鞭毛蛋白是PA鞭毛丝状部的主要蛋白，具有较强的抗原性，flic作为一种疫苗候选分子备受关注[7]。因此，本研究克隆两株水貂PA的flic基因，并与国外分离株进行序列分析及比较，为PA基因工程疫苗的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株和载体 2009年～2011年山东地区分离的PA菌株29株、E.coliDH5α为本实验室保存；pMD18-T购自TaKaRa公司。

1.2 酶类及主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 细菌鞭毛分型 分析比较GenBank登录的PAfilc基因序列，根据保守区域设计分型引物，上游引物：5'-GCCTGCAGATCTCCAACC-3'，下游引物：5'-GGCAGCTGGTTAGCCTG-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以细菌DNA为模板，扩增flic基因的部分片段，根据片段大小确定鞭毛类型。

1.4 引物的设计与目的基因扩增 根据GenBank中登录的PA A型（EF418192.1）和B型（U54775.1）菌株flic基因序列，分别设计两对特异性引物，扩增两型代表株PASD01和PASD03flic的全基因，预期扩增片段 1 164 bp或 1 185 bp和 1 467 bp。A型flic，上游引物：5'-GGATCCATGGCCTTGACCGTC AACA-3'，下游引物：5'-CTCGAGGCGCAGCAGG CTCAGAAC-3'；B型flic，上游引物： 5'-GGATCC ATGGCCCTTACAGTCAACACGA-3'，下游引物：5'-CTCGAGGCGCAGCAGGCTCAGGAC-3'。上游引物和下游引物分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以提取的细菌分离株DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5flic基因的克隆与鉴定 分别回收PCR产物，将其与pMD18-T连接，并转化至E.coliDH5α细胞，提取重组质粒，将鉴定正确的重组质粒分别命名为pMD-flicA和pMD-flicB。

1.6flic全基因的序列测定及分析 将重组质粒由上海生工生物工程技术服务公司测序，利用DNAstar6.0 MegAlign软件，将flic基因的核苷酸序列与GenBank登录的序列进行比对分析。参考序列菌株分别为CF5（AY275674.1）A型、PACF01（EF418192.1）A型、8821M （GU060499.1）A型、LESB58（FM 209186.1）B型、PACF48（EF418194.1）B型、PACF40（EF418193.1）B型、UCBPP-PA14（CP000438.1）B型、PA01（U54775.1）B型、PA01（U54775.1）B型。

2 结果与讨论

2.1 29株分离株鞭毛分型结果 以提取的29个分离菌基因组DNA为模板，经PCR扩增，预期得到1 000 bp左右的片段为A型，得到1 300 bp左右的片段为B型，电泳结果与预期产物大小相符（图1和图2）。29株分离株中，18株为A型，11株为B型。其中1号菌株PASD01为A型鞭毛菌株，3号菌株PASD03为B型鞭毛菌株。

图1 15株分离株的PCR扩增产物Fig.1 Amplification of the 15 strains in the 29 strains by PCR

图2 14株分离株的PCR扩增产物Fig.2 Amplification of the 14 strains in the 29 strains by PCR

2.2 两型菌株flic基因的PCR扩增与鉴定结果以分离株PASD01、PASD03基因组DNA为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，分别扩增出约1 100 bp和1 400 bp的片段，与预期目的片段（1 164 bp或 1 185 bp及 1 467 bp）相符（图 3）。将PCR产物连接pMD18-T载体中进行测序。

图3 flic基因PCR扩增扩增结果Fig.3 Amplification of flic gene by PCR

2.3flic基因的序列测定与分析 经测序结果显示，PASD01分离株flic基因为1 185 bp；PASD03分离株flic基因为 1 467 bp。应用 DNAStar软件中的MegAlign将所测flic基因序列与GenBank中参考株序列进行同源性比较分析，结果显示，PASD01分离株flic基因序列与A型flic基因序列同源性达99.6%～99.7%，PASD03分离株flic基因序列与B型flic基因序列同源性达98.9%～99.5%。而两分离株之间的序列同源性为76%左右。系统进化树分析结果表明，PASD01分离株与A型亲缘关系较近，PASD03分离株与B型菌株亲缘关系非常相近，这与同源性分析结果一致（图4）。

图4 flic基因系统发育分析结果Fig.4 Phyligenetic tree of flic gene from different species

本实验克隆得到水貂PA两种鞭毛类型的flic基因。这两种类型基因在同型H血清型菌株中高度保守，与GenBank中登录的序列同源性均在98%以上，进一步证明PASD01为A型鞭毛菌，PASD03为B型鞭毛菌。PA O抗原血清型众多，但只有两种H抗原血清型：A型和B型，这两种鞭毛蛋白在基因水平上的差异为35%，各型PA表达a型鞭毛或b型鞭毛主要取决于抗原性和由flic基因编码的鞭毛蛋白亚型的分子量大小[8-9]。Montie和Holder等证明用鞭毛制剂免疫小鼠将保护同源H血清型PA菌株攻击的动物，阻止PA从烧伤部位扩散，其保护与攻击菌株的O血清型无关，只要H血清型相同，使用同型的鞭毛疫苗免疫，均可以提供对PA感染的保护性[10-11]。本研究为进一步研究flic基因表达功能性鞭毛蛋白及其应用提供了重要依据，从而有利于PA新型防治方法和鞭毛亚单位疫苗的研制。

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