杨培培，王 颖，胡继明，杨瑞梅，张传美，韩先杰，黄 娟，孙月平，秦晓冰，单 虎

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）也称绿脓杆菌（Bacillus pyocyaners），是一种条件致病菌，该菌广泛存在于自然环境中、人和动物的肠道、皮肤[1]。近年来，由PA引起的动物疫病有上升趋势，我国山东省是水貂养殖大省，不断有养殖场出现大规模PA原发病的报道，给水貂养殖户造成严重的经济损失[2]。临床证明，该菌对大多数防腐剂和抗菌药物表现为天然或获得性多重耐药，所致感染可供选择的有效抗菌药物很少，困扰着临床PA病的治疗[3]。因此，预防PA的感染尤为重要。

PA的鞭毛蛋白能够与粘蛋白、糖脂脱唾液酸以及Toll样受体5结合而诱导炎症反应，在连接天然免疫应答和获得性免疫应答中起重要作用，显示PA鞭毛蛋白具有良好的免疫原性[4-6]。鞭毛蛋白基因（flic）编码的鞭毛蛋白是PA鞭毛丝状部的主要蛋白，具有较强的抗原性，flic作为一种疫苗候选分子备受关注[7]。因此，本研究克隆两株水貂PA的flic基因，并与国外分离株进行序列分析及比较，为PA基因工程疫苗的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株和载体 2009年～2011年山东地区分离的PA菌株29株、E.coliDH5α为本实验室保存；pMD18-T购自TaKaRa公司。

1.2 酶类及主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 细菌鞭毛分型 分析比较GenBank登录的PAfilc基因序列，根据保守区域设计分型引物，上游引物：5'-GCCTGCAGATCTCCAACC-3'，下游引物：5'-GGCAGCTGGTTAGCCTG-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。……