宋建领，张富强，李华春*，杨仕标，王金萍

（1.云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；2.成都军区疾病预防控制中心，云南昆明 650032）

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一种禽类的感染性疾病综合征。近年来，H5N1和H9N2亚型AIV的暴发，特别是H5N1亚型AIV突破种间屏障感染人的病例[1]，赋予AI全新的公共卫生意义。AIV属于正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒成员。AIV基因组由8个节段的单股负链RNA组成，编码10种病毒功能蛋白。病毒第7节段RNA转录过程中，经剪接、编辑合成两条不同的mRNA，翻译合成M 1和M 2基质蛋白。M 1是病毒的主要结构蛋白由252个氨基酸残基组成，分子量约26 ku，占病毒蛋白总量的30%～40%。该蛋白具有型特异性，其抗原性差异是流感病毒分型的依据之一。M 1在病毒复制中还具有重要的调节功能[2]，如控制病毒的转录和被感染细胞的胞核胞浆之间的物质运输[3]。研究表明8位～89位、80位～109位、129位～164位氨基酸区域至少各存在一个B细胞表位，89位～141位氨基酸区域内至少存在2个B细胞表位，存在2个RNA结合位点[4]，羧基端238QAYQKRMGVQMQRFK252肽构成 CD4+T细胞表位[5]，58位～66位（58GILGFVFTL66）氨基酸构成 CD+8细胞毒性 T细胞表位[6]，63位～70位（63FVFTLTVPS70）氨基酸构成CD+4 T细胞表位[7]。

本实验室前期进行了AIV M1、N1和N2基因克隆、表达，获得具有良好抗原性的表达产物[8-10]；并应用噬菌体展示随机12肽库，确定了AIV M1蛋白222位～230位氨基酸（222HPNSSARLR230）构成一个型特异性表位[11]。在此基础上，本研究采用针对AIV的M 1蛋白型特异性单克隆抗体（MAb），淘选M 13噬菌体展示的7肽随机肽库，获得与MAb特异性结合的噬菌体拟位，比对分析噬菌体拟位的共有序列，在病毒M 1蛋白中鉴定相同（似）区域，结合不同噬菌体拟位与MAb的免疫反应性分析结果，进一步进行M 1蛋白表（拟）位分析。

1 材料和方法

1.1 MAb、噬菌体展示随机肽库及主要试剂 AIV M1 MAb、阴性抗体、M 1重组蛋白由有本实验室制备[11]。新城疫病毒（NDV）、H5N1、H9N2 AIV抗原购自哈尔滨兽医研究所。包被重组蛋白G的磁性珠、噬菌体展示的7肽随机肽库（Ph.D.-7TMPhage Display Peptide Library）购自美国 Beverly New England生物实验室；辣根过氧化物酶标记的鼠抗M 13抗体（HRP-IgG）购自Amersham-Pharmacia公司；PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；OPD底物购自Sigma公司。

1.2 肽库库容量滴定及评价 用TBS将待滴定肽库作10-1～10-12稀释，取100μL稀释液与100μL处于对数生长期的ER2738E.coli悬液混合，室温孵育20 min，加至3 ML 42℃的Agarose Top（顶层琼脂糖营养液），立即涂布LB/Agar/Tet/X-gal/IPTG平板，37℃过夜培养，滴定噬菌体蚀斑形成单位（PFU），计算噬菌体浓度。随机挑选20个蓝色的蚀斑对其携带的插入序列进行测序，评价7肽插入序列的随机性和肽库的库容量。

1.3 生物淘选 参照试剂盒说明及参考文献[9]的方法，将5μLM 1MAb、30μL噬菌体肽库（约含9×1010PFU）及165μL含有2%脱脂奶粉的TBS（pH7.5）混合，室温震荡孵育30min，与蛋白G包被磁性珠混合，室温震荡孵育20m in，缓冲液洗涤，用100μL 0.2 mol/L HCl（pH2.2）溶液（含 1 mg/mL BSA）洗脱结合于磁性珠上的噬菌体，并迅速中和至中性。对每一轮淘选获得的洗脱液，除少量稀释后按1.2方法涂布平板，其余用ER2738增殖，纯化，进行下一轮淘选。第二轮和第三轮分别使用2μL和1μL M1 MAb，以增强淘选的特异性。经3轮“淘选-扩增-淘选”，可以富集与抗体特异性结合的噬菌体。

1.4 ELISA 在第3轮淘选后涂布的平板上分别随机挑选48个蓝色噬菌体蚀斑，增殖培养后，以MAb及阴性对照鼠源抗体为包被抗体或捕捉抗体，以鼠抗M 13 HRP-IgG为检测抗体，OPD为底物，进行ELISA检测。当样品针对M 1 MAb的OD490nm值与针对阴性抗体的OD490nm值存在2倍或2倍以上差异时，判为阳性。

1.5 外源插入多肽序列分析 根据野生型噬菌体p III基因（ZY40350）中对所有fd-tet衍生载体均保守的区域，设计引物FUSE-U：5'-GCAAGCTGATAAA CCGATAC-3'， FUSE-D： 5'-CCATGTACCGTAACA CTGAG-3'，经PCR扩增包含外源插入多肽序列（7肽编码序列）的基因片段（约330 bp），产物纯化后，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。采用DNAMAN Version 5.2.2软件进行序列比对，分析7肽序列中的共有序列。

1.6 竞争性ELISA 以MAb为包被抗体，天然病毒抗原为竞争剂或阻断剂，抗M 13 HRP-IgG抗体为检测抗体，OPD为底物，对噬菌体拟位进行竞争性ELISA分析。检测OD490nm值。按以下公式计算：抑制率（%）=（OD490nm缓冲液对照-OD490nm试验）/OD490nm缓冲液对照×100%。设置阳性、阴性及空白对照。

2 结果

2.1 噬菌体展示随机肽库的库容量评价 肽库噬菌体浓度为8×1011pfu/mL。随机挑选20个克隆的序列比对分析结果显示，20个噬菌体克隆中有两个无插入序列，其余18个克隆展示的7肽序列各不相同，并且无相同（相似或共有）序列。

2.2 M1 MAb淘选获得噬菌体克隆的ELISA分析

M 1 MAb第3轮淘选获得的噬菌体洗脱液，经稀释涂布培养后，随机挑选96个蚀斑增殖培养，经ELISA检测与MAb发生特异性结合的噬菌体克隆，结果78个噬菌体克隆为阳性（图1）。

图1 单克隆抗体淘选后噬菌体克隆ELISA分析Fig.1 ELISA analysis of phage clones after panning by MAb

2.3 阳性噬菌体克隆外源插入序列的PCR扩增挑选20个阳性噬菌体克隆，经PCR扩增包含外源插入序列（7肽编码序列）的基因片段，分别获得大小约330 bp的扩增产物（图2）。

图2 阳性噬菌体克隆插入序列PCR扩增Fig.2 PCR amplification of insert sequence from positive phage clones

2.4 阳性噬菌体克隆展示的7肽序列比对分析PCR产物纯化后测序，根据获得的核苷酸序列推导7肽氨基酸序列，20个阳性克隆展示的7肽氨基酸序列比对结果表明，10个克隆含有MDRxL序列（10/20），其中有5个克隆序列完全相同，均为KVMDRWL；有6个克隆序列含有HPR序列（6/20）；2个克隆含有PR序列。1个克隆含有MRxL序列，1个克隆无共有序列序列（表1）。在M 1蛋白氨基酸序列中查找，显示M 1蛋白93位～95位氨基酸序列为MDR，99位氨基酸序列为L，222位～223位氨基酸序列为HP，230位氨基酸序列为R，分别与获得MAb识别的共有序列MDRxL或HPR相似。

表1 淘选后噬菌体展示的7肽序列比对分析Table 1 Alignment of peptide sequences displayed by phage after panning

2.5 竞争性ELISA检测 以M 1 MAb为包被抗体，AIV H5N1、H9N2及NDV抗原为竞争剂或阻断剂，HRP标记的抗M 13抗体为检测抗体，OPD为底物，对噬菌体拟位（KVMDRWL或LTHPRFH）进行竞争性ELISA分析，同时设缓冲液空白对照。结果表明，在缓冲液空白对照成立的前提下，噬菌体拟位（KVMDRWL或 LTHPRFH）与 M1 MAb间的结合，能够被H5N1、H9N2病毒抗原特异性抑制或阻断（H5N1病毒抗原阻断效率高于H9N2病毒抗原的阻断效率），抑制率随病毒抗原浓度降低而降低，而不能被NDV抗原抑制或阻断（图3和图4）。

图3 噬菌体拟位（KVMDRWL）竞争性ELISA分析Fig.3 Analysis of phagemimotope（KVMDRWL）by competitive ELSIA

图4 噬菌体拟位（LTHPRFH）竞争性ELISA分析Fig.4 Analysis of phagem imotope（LTHPRFH）by competitive ELSIA

3 讨论

基于病毒与MAb免疫反应性差异，筛选或构建病毒MAb逃逸株，分析其基因序列差异，以此间接推测抗原表位分布区域及构成表位的关键性氨基酸残基，对高变异性病毒（如AI），难以获得表位精确定位结果[9]。采用分子生物学软件预测病毒蛋白可能的表位区域，需要进一步研究确证。采用噬菌体肽库进行病毒表位分析，可以获得表位及其关键性氨基酸准确定位结果[12-13]。

采用针对M 1蛋白的流感病毒型特异性MAb淘选获得共有序列MDRxL，与M 1蛋白93位～99位（93MDRAVKL99）氨基酸序列结构基本一致。经ELISA、竞争性ELISA分析，携带MDRxL基序的噬菌体能够与MAb发生特异性结合，并且其结合能够被天然病毒抗原特异性抑制或阻断，表明MDRxL序列及其侧翼序列真实模拟病毒蛋白上与MAb结合的抗原决定簇或表位的结构和功能，研究提示M 1蛋白93位～99位（93MDRAVKL99）氨基酸区域构成AIV型特异性表位，93位、94位、95位和99位是构成表位的关键性氨基酸位点。

淘选获得第二个共有序列HPR，与本实验室先前应用噬菌体展示随机12肽库将AIVM 1蛋白型特异表位定位于222位～230位氨基酸（222HPNSSARLR230）的结果一致。一般认为一个MAb针对一个病原表位，本研究使用的AIV型特异性MAb能够与模拟M 1蛋白93位～99位和222位～230位区域的7肽特异结合，可能表明本研究使用的MAb需要进一步克隆纯化。下一步将应用基因分段、截短或连续缺失表达技术和合成多肽进行表位精细定位，研究表位抗原性差异的分子基础。

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