李军星，王一成，袁秀芳，徐丽华，曹会敏，申世川，张鲁滨

（浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是猪Glasser's病的病原体，猪上呼吸道的一种共栖菌，它可以在特定条件下侵入机体从而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。H.parasuis的毒力因子尚不明确，外膜蛋白、荚膜多糖、脂多糖、菌毛、神经氨酸酶等被认为与H.parasuis的致病性有关[1]。对H.parasuis血清5型高致病性菌株SH0165的全基因组测序表明，其中存在很多毒力相关基因，如细胞致死性膨胀毒素基因（Cytolethal distending toxin，CDT）、oapA脂蛋白基因等，但这些基因与细菌毒力的关系有待于研究[2]。

CDT是多种革兰氏阴性致病菌的毒力因子。完整的CDT是由3个不同亚基组成的三聚体，即cdtA、cdtB及cdtC。对其它细菌的CDT的研究表明cdtB亚基是CDT毒素的活性中心，具有Ⅰ型脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）活性，可以诱导多种哺乳动物细胞凋亡[3]。目前所发现的CDT的主要功能是破坏真核细胞的染色体DNA，进而引起细胞凋亡。一方面，它可以抑制上皮细胞增殖，并诱导其凋亡，破坏机体黏膜组织，从而有助于细菌侵入机体；另一方面，它可以抑制宿主免疫细胞的增殖，导致局部的免疫抑制。因此，CDT在细菌与宿主的相互作用中发挥重要作用。本实验对H.parasuisCDT 3个亚基进行原核表达，并证明表达产物具有良好的抗原性，为进一步研究其生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料H.parasuisXS090923-1分离株由本实验室分离鉴定保存；H.parasuis自然感染阳性猪血清分离于浙江省某猪场临床典型病例。DH5α和Rosetta菌株由本实验室保存；PCR试剂、DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、限制性内切酶及pET-28a载体购自TaKaRa公司；二抗SPA-HRP及羊抗兔IgG-HRP购自武汉博士德公司。实验兔由浙江省农科院种兔场提供。

1.2 引物设计 根据H.parasuis菌株XS090923-1的CDT基因序列，通过分析3个亚基cdtA、cdtB、cdtC的信号肽序列，将编码3个亚基信号肽部分基因序列及终止密码子切除后，分别设计针对cdtA、cdtB及cdtC基因的引物，在上下游引物中分别引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点（表1）。

1.3 CDT基因的扩增与克隆 用煮沸法提取菌体基因组DNA[4]，进行PCR扩增。反应条件为：94℃5 Min；94℃ 40 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s， 32个循环；72℃10 Min。PCR产物回收纯化后进行NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，与pET-28a连接，转化，PCR鉴定后，由上海英骏公司测序。将含有cdtA、cdtB及cdtC基因的重组质粒分别命名为pET-cdtAhis、pET-cdtBhis及 pET-cdtChis。

表1 扩增CDT不同亚基的引物Table 1 Primers for amplification of CDT subunits

1.4 重组CDT亚基的western blot分析 提取pET-cdtAhis、pET-cdtBhis及pET-cdtChis重组质粒，转化感受态Rosetta细胞，IPTG诱导，SDS-PAGE检测CDT亚基的表达。利用Ni-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白。将纯化的3个CDT亚基重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干法将其转印至PVDF膜，一抗为1∶50稀释的自然感染猪血清，二抗为1∶3 000稀释的SPA-HRP，DAB显色观察。

1.5 分泌蛋白CDT亚基的western blot分析 将纯化的cdtA、cdtB及cdtC蛋白分别以500μg/只的剂量按常规方法经3次免疫实验兔，制备抗血清。

将XS090923-1株H.parasuis接种于液体TSB培养基（含1%胎牛血清，0.025%NAD），37℃200 r/min过夜培养。离心去除菌体，在上清中加入终浓度10%三氯醋酸（TCA），-20℃放置15 Min，10 000 r/m in离心15 min，弃上清，室温静置5 Min使TCA挥发，用1m L丙酮重悬沉淀，12 000 r/m in离心10m in，弃上清。用1%菌液体积的PBS溶解沉淀，即为制备的H.parasuis分泌蛋白。按1.4中所述方法进行分泌蛋白的western blot分析，其中以大肠杆菌Rosetta裂解液吸附过的兔抗血清（1∶2 000稀释）作为一抗，1∶5 000稀释的羊抗兔IgG-HRP为二抗，以未免疫重组蛋白的兔血清作为阴性对照。

2 结果与讨论

2.1 CDT基因的PCR扩增与克隆 经信号肽分析表明，cdtA、cdtB及cdtC的信号肽长度分别为19、21及19个氨基酸。以H.parasuis分离株XS090923-1基因组DNA为模板，扩增出不含信号肽的cdtA、cdtB及cdtC基因，分别为621 bp、768 bp和471 bp（图1），符合预期大小。将3个目的基因分别克隆至pET-28a，测序结果表明插入的目的基因阅读框正确。

图1 CDT3个亚基基因的大小Fig.1 Size of gene of three CDT subunits

2.2 重组CDT亚基的抗原性分析 将纯化的重组蛋白与H.parasuis自然感染阳性猪血清进行western blot试验，结果显示3个蛋白均可以被猪血清识别，表明所表达的重组蛋白cdtA、cdtB和cdtC均具有良好的反应原性（图2）。将H.parasuis体外培养的分泌蛋白及重组CDT亚基与用重组蛋白制备的兔抗血清进行western blot试验，结果显示所制备的阳性血清能够识别分泌蛋白中的cdtA、cdtB及cdtC亚基，并且分泌蛋白中的cdtA、cdtB及cdtC亚基与相应的切除信号肽的重组CDT亚基分子量相似，表明重组蛋白具有良好的免疫原性（图2）。

图2 重组CDT亚基的免疫原性及反应原性鉴定Fig.2 Identification of immunogenicity and reactinogenicity of recombinant CDT subunits

本研究对H.parasuisCDT 3个亚基进行信号肽分析表明，3个亚基均含有约20个氨基酸的信号肽。3个切除信号肽的亚基在大肠杆菌中均得到表达，但cdtA与cdtC亚基的分子量均明显大于理论值，这可能与表达的融合蛋白His-tag结构有关。唐威华等也证明His-tag确实是造成偏差的主要原因[6]。通过SDS-PAGE电泳显示的原核表达重组蛋白分子量比理论值高的现象比较常见[6-7]，但并非所有His-Tag融合蛋白表观分子量都偏大，比如本研究中的重组cdtB蛋白表观分子量与理论值基本相符，因此还存在其它影响表观分子量的因素。

纯化的重组CDT亚基均可以被自然感染猪阳性血清所识别，表明H.parasuis在猪体内定殖或感染的过程中分泌了大量CDT毒素，足以刺激机体产生抗体，因此该毒素也许在其致病过程中发挥作用。某些致病菌CDT基因仅在其侵入宿主细胞时才启动表达[8]，为了验证H.parasuis的CDT毒素是否也是相同的情况，我们将H.parasuis体外培养时的分泌蛋白进行western blot试验，结果证明H.parasuis在体外培养时也表达CDT毒素。并且分泌蛋白中CDT亚基与大肠杆菌表达的相应重组亚基的分子量相当，表明重组CDT亚基信号肽的分析结果与实际相符。因此，为进一步研究重组蛋白在体外组装成完整的CDT毒素奠定了良好的基础。

[1]蔡旭旺.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D].武汉：华中农业大学，2006.

[2]Yue Min,Yang Fan.Complete genome sequence ofHaemophilus parasuisSH0165[J].JBacteriol,2009,191（4）:1359-1360.

[3]Jinadasa R N,Bloom S E,Weiss R S,et al.Cytolethal distending toxin:a conserved bacterial genotoxin that blocks cell cycle progression,leading to apoptosis of a broad range ofmammalian cell lineages[J].M icrobiol,2011,157:1851-1875.

[4]de la Puente Redondo V A,Navas Mendez J,Garcia del Blanco N,et al.Typing ofHaemophilus parasuisstrains by PCR-RFLP analysis of the tbpA gene[J].Vet Microbiol,2003,2511:1-10.

[5]唐威华，张景六.SDS-PAGE法测定His-tag融合蛋白分子量产生偏差的原因[J].植物生理学报，2000，26（1）：64-68.

[6]付媛，卢福庄，石团员，等.日本血吸虫Sj22.6-LHD-Sj23融合基因的克隆及原核表达[J].中国预防兽医学报，2010，32（11）：904-907.

[7]马波，李洪涛.鸭肠炎病毒gB胞浆区基因片段的克隆及原核表达[J].中国兽医科学，2011，41（06）：607-609.

[8]Haghjoo E,Galan J E.Salmonella typhi encodes a functional cytolethal distending toxin that is delivered into host cells by a bacterial-internalization pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:4614-4619.