孟庆峰，刘 阳，刘金华，宋战昀，吕文雪，王伟利*，钱爱东*

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118；2.吉林出入境检验检疫局，吉林长春130062)

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)引起的一种鲤鱼和锦鲤的传染性疾病，鱼感染KHV后可在24 h～48 h内死亡，病死率高达80%～100%。该病于1997年在以色列首次发现，先后在世界十几个国家和地区传播与流行[1]。随着国际进出口贸易的扩大，该病给世界的养渔业造成了严重的危害[2]，引起世界各国的广泛关注。该病的临床症状主要表现为病鱼停止游动；皮肤上出现白斑和水泡；鳃出血，产生大量的粘液或组织坏死；鳞片有血丝等症状[3-4]。

目前，该病的检测方法有电镜检测、ELISA、PCR、荧光PCR等[5-9]。在国内PCR方法可作为疫情检测及确诊手段之一，也是OIE诊断手册推荐的检测方法[10]。OIE手册提供的PCR方法涉及DNA聚合酶基因(Sph)和胸苷激酶基因(TK)两个基因，它们可以彼此互相验证。本研究建立一个体系同时扩增Sph与TK两个基因的方便、快捷、灵敏的PCR检测方法，为该病的预防和控制提供了强大的技术支持。

1 材料和方法

1.1 病毒株和细胞 KHV株购于ATCC(VR-1592)，锦鲤鳍细胞系(Koi Fin cell line KF-1)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和鲤鱼疱疹病毒(CHV)核酸由吉林农业大学动物科技学院提供。

1.2 主要试剂 组织基因组DNA提取试剂盒、Ex-Taq聚合酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、pMD18-T载体、DNA Marker、PCR试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计与合成 参照GenBank中登录的Sph基因(AB375381.1)和TK基因序列(AB375391.1)设计并合成两对引物(表1)。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences of PCR

1.4 核酸提取与最佳退火温度选择 将KHV标准病毒VR1592接种KF-1细胞，待出现细胞病变收获细胞病毒。用组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞毒的核酸做为扩增的模板，退火温度分别设置为47℃、52℃、57℃，进行PCR反应。25 μL PCR扩增体系：DNA 模板 3 μL，10×ExTaqbuffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mM)2 μL，引物 Sph1 0.8 μL(10 pM)，引物 Sph2 0.8 μL(10 pM)，引物 TK1 1 μL(10 pM)，引物 TK2 1 μL(10 pM)，ExTaq酶(5 U/μL)0.4 μL，DEPC处理水补到25 μL。PCR反应参数：94℃5 min；95℃ 1 min、57℃ 1 min、72℃ 1 min，30个循环，72℃10 min；4℃保温。以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。利用凝胶回收试剂盒将Sph基因和TK基因PCR扩增产物分别回收，将回收的产物与pMD18-T载体连接，将连接产物转化到DH5感受态细胞，经培养后，挑取阳性克隆菌进行测序。

1.5 双基因PCR检测特异性试验 应用优化的双基因PCR检测方法检测KHV、SVCV、IHNV和CHV核酸。并设立无模板阴性对照，在已优化的反应条件及反应体系下进行PCR扩增，通过电泳及凝胶成像仪分析检测方法的特异性。

1.6 双基因PCR检测敏感性试验 利用基因组DNA提取试剂盒提取KHV核酸，核酸蛋白检测仪测其浓度为56 ng/μL，将提取的核酸用无菌的DEPC水10倍系列稀释10-1～10-6，按所建立的PCR反应体系及条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析。

1.7 双基因PCR检测临床样品 应用所建立的双基因PCR方法将30份细胞培养物与功毒鱼组织样本进行检测，同时利用单一PCR进行检测，以检测双基因PCR方法的应用情况。

2 结 果

2.1 退火温度的选择结果 在其它条件与体系不变的情况下将退火温度设定为47℃、52℃、57℃进行双基因PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，电泳结果如图1所示，当退火温度为57℃时，两基因分别在155 bp和570 bp处出现目的条带，并且扩增效率较高。将扩增片段进行序列测定与分析，结果与已知相符。

2.2 特异性试验结果 以优化的方法检测该方法对SVCV、IHNV、CHV的特异性。结果表明，KHV扩增出特异性片段，SVCV、IHNV、CHV均无扩增片段。该方法具有较强的特异性，无病原交叉反应(图 2)。

2.3 敏感性试验结果 利用建立的方法，将不同稀释倍数的模板进行扩增，每个反应体系可检出TK基因DNA含量为5.6×10-1ng/μL；可检出Sph基因DNA含量为 5.6×10-2ng/μL。两种基因同时检出DNA 含量为 5.6×10-1ng/μL(图 3)。

2.4 样本的检测结果 应用建立的方法对样本进行检测，同时检测结果与单一PCR结果进行比较。结果显示，双基因PCR结果与单一PCR检测结果的符合率为100%(表2)，表明该方法可以用作双基因同时检测出具检测结果。

表2 样本检测Table 2 Sample detection

3 讨 论

锦鲤疱疹病毒病是严重威胁鲤鱼和锦鲤养殖业安全的一种疾病，OIE列为必须通报的疾病，我国将其列为二类疫病[11]。由于该病毒没有敏感的细胞系，因此对它的研究较少，国内外学者正在对该病进行广泛深入研究，人们期待对锦鲤疱疹病毒病的防控取得巨大突破，目前研究的方向仍然是该病的早期诊断及疫苗研制[12]，PCR技术等已逐渐应用到锦鲤疱疹病毒病的诊断中，这些诊断技术简便、快速、准确、灵敏，是比病毒分离、电镜观察更加易行的诊断方法，已广泛用于该病的早期诊断，国家出入境检验检疫标准的PCR检测方法已推广应用[13]。

多重PCR技术目前应用于病原检测，具有独特的优势。其是在常规PCR基础上发展起来的检测技术，该技术可在同一个反应体系中加入一对以上引物，分别扩增不同的目的片段[14]。该技术具有检测两种病原或两个基因的特点且具有单个PCR无可比拟的优越性，消耗时间和试剂少，减轻了工作量等等。目前，常规诊断KHV感染的方法如病毒学试验、血清学试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高，不能满足快速、准确诊断的要求。OIE动物疫病诊断手册建议PCR检测方法用两种不同基因进行检测以保证结果的特异性和可靠性。

本研究建立的双基因PCR可同时检测两个基因且敏感性高、特异性好。与单一PCR进行比较，符合率达100%，而且可在同一时间内扩增两个目的基因，大大提高了检测效率，适用于临床检验，为进一步研究KHV以及诊断的应用奠定了基础。

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