许红丽，易 立，王建科，杨 莘，程世鹏

(中国农业科学院特产研究所，吉林吉林132109)

犬瘟热(Canine distemper，CD)是犬科动物最主要的病毒性疾病之一，是由犬瘟热病毒(CDV)感染犬或其他食肉动物引起的高度接触传染性、致死性疾病[1]。CDV为有囊膜的单股负链RNA病毒，编码6种结构蛋白：两种囊膜糖蛋白，融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)，基质蛋白(M)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和核蛋白(N)[2]。CD的治愈率极低，早期病例可望治愈，中后期病例治愈困难，因此快速早期诊断CD极其重要。

传统的细胞分离培养方法，所需要的时间长，病毒分离率低；电镜检查法只能观察病毒的形态，不易与同科的病毒区分；免疫荧光技术敏感性较低；酶联免疫吸附实验及其他血清学方法不适合早期诊断[3]。常规PCR技术只能定性检测，敏感性低。而荧光定量RT-PCR可以快速和定量检测CDV，本研究选择NP基因，建立检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法，以期有助于分析CDV感染动物体内的病毒含量变化，对研究CDV的致病性具有重要价值。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞及主要试剂 CDV PS株、水貂阿留申病毒(ADV)、犬腺病毒(CAV)、犬细小病毒(CPV)均由本实验室分离、鉴定和保存；Vero细胞购自中科院上海细胞库；RNA提取试剂TRIzol LS reagent购自Invitrogen公司；One Step SYBR Prime-Script PLUS RT-PCR试剂盒、pMD18-T均购自TaKaRa公司；DH5α菌株由本实验室保存。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank中CDV3株序列(EU726268)，设计两对特异性扩增CDV NP基因片段的引物。检测引物上下游分别为5'-AGCTA GTTTCATCTTAACTATCAAGTT-3'；5'-TTAACTCT CCAGAAAACTCATGC-3'，扩增片段为83 bp。构建重组质粒的标准品上下游引物分别为5'-ATGAACA AAATCTGGCTTGATAT T-3'；5'-TGCACTAAATTTG TTCTGAACAGAA-3'，扩增片段为364 bp。以CDV PS cDNA作为模板，进行PCR。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.3 阳性重组质粒标……