杨 睿,张素辉,徐登峰,许国洋,付利芝

（1.重庆市畜牧科学院,重庆 荣昌 402460）

化脓隐秘杆菌（Arcanobacterium pyogenes）属于隐秘杆菌属成员,是一种条件性致病菌。该菌主要寄生在牛、羊及野生反刍动物的上呼吸道、消化道等黏膜处,常与大肠杆菌、连球菌等混合感染,导致家畜发生肺炎、关节炎、皮下脓肿、流产、死胎等现象,同时也可能引起人感染致病,给人类健康带来了重大的威胁[1-2]。

近年来,三峡库区养羊业的发展迅速,从外地大量引进优良羊种;由于库区95%的面积由丘陵和山脉组成[3],养殖生产条件良莠不齐,外加冬季阴冷潮湿,夏季高温高湿,使得各类疾病一直散发流行。由于养殖条件艰苦一些在外界少有暴发的疾病,也在库区陆续发现。此研究针对三峡库区主要的山羊养殖区县对化脓隐秘杆菌的流行情况进行调查。

1 材料及方法

1.1 病料的采集 2014年3月至2016年12月间在三峡库区各地采集肺炎和淋巴结化脓病料。

1.2 细菌的分离鉴定

1.2.1 细菌学检查 在无菌环境下将病料接种在含10%小牛血清TSA琼脂培养基上,细菌纯化后进行革兰染色,并镜检。

1.2.2 PCR检测 挑取纯单个菌落至10%小牛血清TSA液体培养基中培养,37℃,120 r/min,培养24 h,采用OMEGA Bacterial DNA Kit试剂盒提取细菌基因组,引物为自行设计的特异性引物[4],进行PCR。

1.2.3 致病性试验 对鉴定为阳性的病原进行致病性试验,选取健康的昆明系小鼠进行腹腔注射,攻毒组（n=5）每只小鼠注射0.1 mL,浓度为1×109CFU/mL-1的菌液,健康组（n=5）每只小鼠注射0.1 mL的营养肉汤,观察接种后小鼠的症状。

2 结果

2.1 病料的采集 从三峡库区的巫山、云阳、忠县、石柱、丰都、武隆地区共采集病料72份。其中肺炎病料57份,淋巴结化脓病料14份。

2.2 病原菌的分离鉴定 通过纯化培养、镜检和特异性PCR,共分离到5株化脓隐秘杆菌,其中从肺炎病料中分离到化脓隐秘杆菌3株,分离率为5.26%（3/57）,从淋巴结化脓病料中分离到化脓隐秘杆菌2株,分离率为14.28% （2/14）。见图1。

图1 细菌分离株革兰染色结果（1 000×）

2.3 PCR检测结果 使用化脓隐秘干菌特异性引物对分离菌株进行PCR扩增,均能扩增出1 378 bp的片段（图2）,测序后在GenBank上进行比对,与化脓隐秘杆菌（FN39498）的相似性大于99%。

图2 PCR扩增结果

2.4 致病性试验的结果 组1和组2的攻毒菌来自淋巴结化脓病料,组3、组4和组5的攻毒菌来自肺炎病料,组6为健康对照组。接种细菌的小鼠在24 h后出现精神萎靡,反应迟钝等症状,并在4 d后开始出现死亡,2周后组1与组3的死亡率最低,均为20%,组2的死亡率最高为80%,健康对照组中的小鼠均正常（表1）。

表1 分离菌对小鼠的攻毒结果

3 讨论

化脓隐秘杆菌是一种条件性致病菌,在外界条件发生变化时容易引起动物发病。但是以往关于化脓隐秘杆菌引起疾病的报道主要集中在牛上[5],多呈零星的散发状态,关于山羊化脓隐秘杆菌的研究较少。然而三峡库区是一个高温高湿地区,整体经济情况落后,养殖条件艰苦,为各种疫病的流行创造了天然的条件。在此项研究中,我们重点研究了化脓隐秘杆菌在三峡库区的自然感染情况。从2014年3月至2016年12月,共收集到山羊肺炎病料57份,淋巴结化脓病料14份,通过分离鉴定共收集到5株有毒力的化脓隐秘杆菌,其中从肺炎病料中分离到3株,分离率为5.26%（3/57）,从淋巴结化脓病料中分离到化脓隐秘杆菌2株,分离率为14.28% （2/14）。这个比列远远高于预想,而且由于库区的养殖条件和气候条件,实际情况或许更为严重。因此对三峡库区动物疫病的监测不应该只局限于当前主要的流行疾病,各地兽医主管部门也应该对一些易发的条件性疫病进行监测。