王 丰 屠冠军 朱 悦

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

Nogo－66是脊髓损伤后抑制神经再生的重要因子。本研究前期工作发现神经干细胞表达Nogo－66的受体（Nogo－66receptor，NgR），神经干细胞分化过程中神经元的神经突生长会受到Nogo－66活性片段Nogo－p4的抑制［1］。在后续研究中，我们发现神经干细胞在其分化形成星形胶质细胞的过程中，星形胶质细胞的亚型之一双极形星形胶质细胞的突起生长也可以被Nogo－p4所抑制，并且该抑制作用由NgR所介导，现报道如下。

材料和方法

1.实验动物

出生后24h内的Wistar大鼠由中国医科大学动物实验中心提供。

2.主要试剂

表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、NgR和nestin兔抗鼠单克隆抗体购自Chemicon公司；碱性成纤维细胞生长因子（basal fibroblast growth factor，bFGF）、DMEM/F12培养基、B27、Alexa Fluor®488羊抗兔荧光二抗、PI和Zenon Tricolor荧光标记 试 剂 盒、Block－It Fluorescent Oligo 、LIPOFECTAMINE 2000REAGENT和OPTI MEM I均购自Invitrogen公司；神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）兔抗鼠单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）兔抗鼠单克隆抗体和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）兔抗鼠单克隆抗体购自武汉博士德公司。Nogo－p4购自ADI公司。Western blot蛋白检测试剂盒购自KPL公司。

3.神经干细胞的分离和培养

取4只出生24h内的Wistar大鼠，处死后在超净台内取出大鼠脊柱，以眼科剪刀剪开椎板，取出脊髓置入装有4℃D－Hanks液平皿中。将脊髓剪碎，清洗后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化40min，离心弃去胰酶，加入添加有B27、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的 DMEM－F12培养基，重悬浮，200目细胞筛过滤后接种于培养瓶中（1×108/L），置于37℃5%CO2培养箱中培养，每3－4d更换培养液。

4.神经干细胞的鉴定

4.1 Nestin免疫荧光染色

培养1w后，取神经球以冷丙酮固定10min，滴在载玻片上烘干，0.01mol/L PBS漂洗3次，5%BSA封闭15min，弃去血清滴加nestin兔抗鼠单克隆抗体，以PBS代替一抗作为对照，4℃过夜。……