王 丰 屠冠军 朱 悦

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

Nogo－66是脊髓损伤后抑制神经再生的重要因子。本研究前期工作发现神经干细胞表达Nogo－66的受体（Nogo－66receptor，NgR），神经干细胞分化过程中神经元的神经突生长会受到Nogo－66活性片段Nogo－p4的抑制［1］。在后续研究中，我们发现神经干细胞在其分化形成星形胶质细胞的过程中，星形胶质细胞的亚型之一双极形星形胶质细胞的突起生长也可以被Nogo－p4所抑制，并且该抑制作用由NgR所介导，现报道如下。

材料和方法

1.实验动物

出生后24h内的Wistar大鼠由中国医科大学动物实验中心提供。

2.主要试剂

表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、NgR和nestin兔抗鼠单克隆抗体购自Chemicon公司；碱性成纤维细胞生长因子（basal fibroblast growth factor，bFGF）、DMEM/F12培养基、B27、Alexa Fluor®488羊抗兔荧光二抗、PI和Zenon Tricolor荧光标记 试 剂 盒、Block－It Fluorescent Oligo 、LIPOFECTAMINE 2000REAGENT和OPTI MEM I均购自Invitrogen公司；神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）兔抗鼠单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）兔抗鼠单克隆抗体和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）兔抗鼠单克隆抗体购自武汉博士德公司。Nogo－p4购自ADI公司。Western blot蛋白检测试剂盒购自KPL公司。

3.神经干细胞的分离和培养

取4只出生24h内的Wistar大鼠，处死后在超净台内取出大鼠脊柱，以眼科剪刀剪开椎板，取出脊髓置入装有4℃D－Hanks液平皿中。将脊髓剪碎，清洗后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化40min，离心弃去胰酶，加入添加有B27、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的 DMEM－F12培养基，重悬浮，200目细胞筛过滤后接种于培养瓶中（1×108/L），置于37℃5%CO2培养箱中培养，每3－4d更换培养液。

4.神经干细胞的鉴定

4.1 Nestin免疫荧光染色

培养1w后，取神经球以冷丙酮固定10min，滴在载玻片上烘干，0.01mol/L PBS漂洗3次，5%BSA封闭15min，弃去血清滴加nestin兔抗鼠单克隆抗体，以PBS代替一抗作为对照，4℃过夜。0.01mol/L PBS漂洗3次，滴加5μg/mlAlexa Fluor®488羊抗兔荧光二抗，避光室温孵育1h。PBS漂洗3次，甘油封片，荧光显微镜下观察照相。

4.2 诱导分化

取神经球尽量吹打分散成单细胞，将神经干细胞悬液（1×108/L）加入预先已置入玻璃盖片（直径14mm）的6孔培养板中，加入10%胎牛血清。7d后取出盖片，分别以NSE，GFAP和MBP抗体标记，PI标记细胞核，常规方法免疫荧光染色。

5.小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的设计和合成

利用Invitrogen公司网上siRNA设计软件设计3条大鼠NgR mRNA的siRNA，由Invitrogen公司进行合成相应的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）。经预试验筛选出阻断NgR基因最有效的一条dsRNA，其序列为：

Sequence（5＇to 3＇）：－UGC AGU ACC UCU ACC UAC AAG ACA ASequence（5＇to 3＇）：－UUG UCU UGU AGG UAG AGG UAC UGC A随机打乱顺序的siRNA（scrambled siRNA）作为阴性对照也由Invitrogen公司进行合成。

6.实验分组

将神经干细胞分为A，B，C，D四组。将神经球尽量吹打分散成单细胞，将神经干细胞悬液加入已放入盖片的六孔培养皿中，A组加入10%胎牛血清使神经干细胞开始分化；B组加入10%胎牛血清和4μmol/L的 Nogo－p4［1］；C组的神经干细胞悬液经过NgR基因特异性siRNA转染24h后，加入10%胎牛血清；D组的神经干细胞悬液经过NgR基因特异性siRNA转染24h后，加入10%胎牛血清和4μmol/L的 Nogo－p4。

7.siRNA的转染

取1ml含神经干细胞的培养液加入离心管，800r/min离心5min，弃上清，加入900μl不含抗生素的培养基，机械吹打分散细胞。

a.将50pmol NgR基因特异性siRNA用50 μl of Opti－MEM 稀释，混匀。

b.将1μl Lipofectamine.2000加入50μl Opti－MEM，混匀，室温孵育15min。

c.混合a液和b液，轻柔混合，室温孵育15min。

将混合物加入神经干细胞悬液中，置于37℃5%CO2培养箱中孵育，于24h后检测NgR基因表达。另取部分神经干细胞以荧光标记的siRNA（Block－It Fluorescent Oligo）进行相同条件下的转染，荧光显微镜下观察并计算转染效率。

8.NgR基因表达的检测

8.1 免疫荧光染色

转染24h后的神经干细胞悬液800r/min离心5min，丙酮固定，滴在盖片上晾干，牛血清封闭非特异性背景15min，加入NgR兔抗鼠单克隆抗体过夜，PBS洗3次，滴加5μg/mlAlexa Fluor®488羊抗兔荧光二抗，避光室温孵育2h。PBS漂洗3次，PI染色细胞核5min，PBS漂洗3次，甘油封片，荧光显微镜下观察照相。每张盖片随机取10个视野，计数NgR阳性细胞数N和总细胞数T，计算阻断效率（T－N）/T。实验重复3次。

8.2 Western blot

细胞悬液经离心收集细胞，弃去上清，加400μl裂解液，冰上裂解30min。将裂解液4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中。用Bradford法进行蛋白质定量。蛋白上样量30μg，上样前将样品于沸水中煮5min。电泳后转印到硝酸纤维素膜。5%的脱脂牛奶封闭非特异性背景，室温1h。将兔抗鼠NgR抗体用TBST稀释至1∶400，将膜放入一抗稀释液中，4℃过夜。用TBST在室温下洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育2h。用KPL公司的蛋白检测试剂盒显色。

9.双极形星形胶质细胞的突起长度的测量

分化第7d，每组取3片盖片，进行GFAP荧光标记，PI标记细胞核。荧光显微镜下观察照相，计数阳性细胞数和总细胞数，观察星形胶质细胞形态，将其分类。使用Image－Pro Plus 5.0软件进行双极形星形胶质细胞突起长度的测量［2］。每次实验在200倍荧光显微镜下随机选取10个视野进行测量，实验重复3次，取平均值。

10.统计学分析

实验数据以SPSS11.5软件进行处理，差异显著性采用单因素方差分析。

结 果

悬浮培养的细胞形成典型的神经球，经免疫荧光检测nestin表达阳性。加入10%胎牛血清分化1周后，可观察到NSE，GFAP和MBP标记阳性的细胞。这表明培养出的神经球具备分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，是神经干细胞。参见本研究前期报道［1］。神经干细胞经NgR基因特异性siRNA转染后大部分细胞存活，少量细胞死亡，存活的细胞活力良好，超过24h后不再出现细胞死亡。Western blot检测的结果证实经NgR基因特异性siRNA转染后24h的神经干细胞NgR表达显著降低。参见本研究前期报道［3］。

GFAP是公认的星形胶质细胞的标志物。分化第7d，各组均可观察到形态显著不同的GFAP＋细胞。胞体延长形星形胶质细胞细胞体延长，细胞突起明显，分支较少或没有分支（图1A）。星状星形胶质细胞具有较小的细胞体，星状的突起分支多而明显（图1B）。双极形星形胶质细胞为双极细胞，两侧各有一细长突起，没有分支，A－D组分别对应图1C，D，E，F。双极形星形胶质细胞在各组中占GFAP＋细胞的比率见表1，组间没有显著差异。各组中双极形细胞形态基本一致。B组（图1D）中双极形细胞的突起长度明显短于其它各组（图1C，E，F），P＜0.01。A，C和D组间双极形细胞的突起长度没有显著差异。经显微测量，各组中双极形细胞突起的平均长度见表1。

表1 双极形细胞占GFAP＋细胞的比率和突起平均长度（n＝4）Table1 The ratio of bipolar astrocyte in GFAP＋cells and the average process length of bipolar cells

讨 论

神经干细胞（NSC）可分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，这使得NSC移植治疗脊髓损伤成为可能。以往研究者多致力于提高神经干细胞分化形成神经元的比率，认为神经元在神经功能恢复过程中起主导作用。星形胶质细胞因其在脊髓损伤后形成胶质瘢痕，曾被认为是轴突再生的障碍［4］。近年来有体外实验证实星形胶质细胞具有合成和分泌营养因子的功能，可以促进神经元的轴突生长［5］。现在认为星形胶质细胞对再生轴突具有阻碍轴突穿越和分泌神经营养因子促进轴突再生的双重作用［6］。随着人们对其多样性和功能的复杂性逐渐认识，星形胶质细胞的分类和功能重新成为研究的热点和难点，神经干细胞定向分化成星形胶质细胞的工作也逐渐开展。神经干细胞分化形成的星形胶质细胞不仅可以补充和替代中枢神经系统损伤区的细胞，还可以维持神经元的存活和促进轴突的生长，甚至可以做为药物载体长期发挥治疗作用［7，8］。

微环境决定了干细胞分化结局和分化细胞亚型特点，细胞外基质中的成分对神经干细胞分化形成星形胶质细胞的影响是微环境调控的研究热点［9］。Nogo－66是脊髓损伤后微环境中重要的神经再生抑制因子，Grandpre T等发现Nogo－66的活性片段Nogo－p4在浓度为4μmol/L时可以抑制鸡胚背根神经节细胞神经突生长［10］。本研究前期工作发现神经干细胞表面表达 Nogo－66受体（NgR），Nogop4通过NgR可以抑制神经干细胞分化形成神经元的神经突生长［1］。在后续研究中，我们发现神经干细胞可以分化成不同形态的星形胶质细胞，Nogop4对神经干细胞分化形成的双极形星形胶质细胞的突起生长也有抑制作用。为证实该抑制作用是否由NgR所介导，进行了本次实验研究。

本研究证实大鼠脊髓来源的神经干细胞在体外能够分化成不同形态类型的星形胶质细胞亚型。Robert H Miller最早报道了体外培养大鼠脊髓的不同形态的星形胶质细胞［11］。本研究中神经干细胞分化成的星形胶质细胞分别对应于Robert H Miller研究中的胞体延长形，星形和双极形。国外学者针对胶质细胞的异质性，不同形态的胶质细胞的不同功能进行了探索性的研究。目前还不清楚不同形态的星形胶质细胞在中枢神经系统损伤后发挥何种作用［12］。

本研究表明，神经干细胞分化过程中加入Nogo－p4可以明显抑制双极形星形胶质细胞的突起生长。双极型星形胶质细胞的功能目前仍不清楚，有学者认为它与神经细胞远距离通讯有关。其突起长度的变化对功能的影响有待进一步研究。已有研究指出，星形胶质细胞形态的改变可能具有重要的功能意义［13］。经siRNA转染导致NgR基因沉默的神经干细胞可以正常分化成双极形星形胶质细胞，且其占总体星形胶质细胞的比率保持不变，突起长度与对照组相比没有显著差异。在NgR基因沉默的神经干细胞中加入Nogo－p4并分化后，双极形星形胶质细胞的突起长度没有明显缩短。因此，Nogo－p4对双极形星形胶质细胞的突起生长抑制作用可以被NgR基因沉默所阻断，间接证实了该抑制作用是通过NgR所介导的。

本研究报道了Nogo－p4对神经干细胞分化成双极形星形胶质细胞的突起长度影响情况，结合以往的研究成果，Nogo－66不但对神经干细胞分化成神经元有影响，也对星形胶质细胞的分化产生影响，而且这些影响都是通过NgR所介导，这对于星形胶质细胞异质性研究和神经干细胞定向分化研究有一定参考价值。我们将在后续研究中进一步探索双极型星形胶质细胞的突起的功能意义，观察神经干细胞移植到动物体内后分化成星形胶质细胞亚型的情况，这对于理解神经干细胞移植后的分化过程，改善神经干细胞移植治疗脊髓损伤的效果具有重要意义。

［1］王丰，朱悦.Nogo－p4对神经干细胞分化成神经元样细胞的影响.中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16（5）：564－568

［2］Li W，Walus L，Rabacchi SA，et al.A neutralizing anti－Nogo66receptor monoclonal antibody reverses inhibition of neurite outgrowth by central nervous system myelin.J Biol Chem，2004，279（42）：43780－43788

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