张 鑫 董亚楠 杨石强 黄 鹂 付银锋 张春瑞 (河南科技大学医学院解剖学教研室，洛阳 471003)

目前研究发现，肥大细胞是一种功能复杂、多样的异质性细胞，其在机体中分布广泛，尤其集中于血管附近，在皮肤与黏膜等与外界相邻的组织中数量较多。肥大细胞颗粒中含有较多的组胺，是体内组胺的主要来源。近年来研究发现，肥大细胞除参与机体的过敏反应外，尚与防御、修复、抗肿瘤及组织修复与重建有关。血管活性肠多肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)及降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)是神经末梢中广泛分布的神经多肽，有报道指出，在这些神经末梢的周围存在有丰富的肥大细胞，因此认为这种分布与神经-免疫对话(Nerve-immune cross-talking)机制有关［1，2］。VIP 及 CGRP 对肥大细胞功能影响的报道不多，且有相互矛盾之处［3，4］。本文应用 VIP、CGRP分别作用于分离的大鼠腹腔肥大细胞(Rat peritonealmast cells，RPMCs)以检测他们对大鼠肥大细胞脱颗粒及细胞内［Ca2+］离子浓度的影响;同时应用VIP受体结合抑制剂(L-8-K)预处理RPMCs，以观察神经多肽对大鼠肥大细胞功能的调节作用及其作用机制，了解这些神经多肽与肥大细胞的相互关系。

1 材料与方法

1．1 实验动物 成年雄性SD大鼠购于韩国大田试验动物中心，体重250～300 g。大鼠被置于层流动物饲养柜中，室温(23±2)℃，湿度(55±5)%，光照时间为7．00点～19．00点。饲以颗粒鼠饲料，自由饮水。

1．2 试剂 VIP、CGRP、L-8-K购自 Bachem 公司;48/80复合物、HEPES、牛血清白蛋白购自美国Sigma公司;Percoll细胞分离液购自瑞典Pharmacia公司;同位素组胺检测试剂盒、45Ca检测试剂盒购自美国PerkinElmer公司。

1．3 大鼠腹腔肥大细胞悬液的制备 用乙醚吸入麻醉SD大鼠，腹腔内注射 HEPES-Tyrode缓冲液(136 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，11 mmol/L NaHCO3，0．6 mmol/L NaH2PO4，2.75 mmol/L MgCl2，5．4 mmol/L HEPES，1．0 g/L 牛血清白蛋白，1．0 g/L 葡萄糖，0．1 g/L 肝素，pH7．4)10 ml，轻轻按摩腹部90秒，打开腹腔，用巴氏吸管收集腹腔内液体，以Percoll密度梯度法纯化肥大细胞。台盼蓝排除试验显示98%是活细胞;甲苯胺蓝染色检测显示95%的细胞是肥大细胞。纯化后，用HEPES-Tyrode缓冲液将其重新混悬成1×106肥大细胞/ml，置冰上备用。

1．4 组胺检测 按照Choi等［5］描述的免疫酶法测定肥大细胞组胺释放率。每Eppendorf管加入肥大细胞悬液200μl，37℃ 水浴预孵5分钟，分别加入VIP、CGRE 使成不同的终浓度，5×10－7mg/L 48/80复合物作为阳性对照，0浓度阴性对照不加作用物而加入等量HEPES-Tyrode缓冲液;继续孵育20分钟后，置冰上终止反应;4℃ 3 000 r/min离心10分钟分离细胞，获取上清液。沉淀细胞用煮沸法破碎，离心，取上清液;同位素放射酶法、液态闪烁计数仪(Tri-carb 2900TR，美国Packard Bioscience公司)分别检测两种上清液中组胺的含量。组胺释放百分率=上清液中组胺的释放量/总组胺量(上清液中组胺释放量+细胞中残留组胺的量)×100%。

1．545Ca摄入量测定 以1×106细胞/ml的浓度将肥大细胞重新混悬于含 1．5μCi/ml45Ca的HEPES-Tyrode缓冲液中，4℃孵育10分钟后，分装，每Eppendorf管200μl;37℃预孵育10分钟，分别加入VIP、CGRE使成不同的终浓度，5×10－7mg/L 48/80复合物作为阳性对照;37℃继续孵育10分钟后，加入4℃预冷的1 mmol/L LaCl3，终止反应;4℃3 000 r/min离心10分钟，洗涤细胞3次;洗涤后的细胞加入10%Triton X-100剧烈震荡破碎细胞，用液态闪烁计数仪分别检测各组细胞的45Ca摄入量。

1．6 L-8-K对VIP诱导RPMC功能的抑制作用在RPMC中加入VIP之前，首先加入终浓度为5×10－6mol/L的L-8-K 25μl，37℃ 水浴预孵育5分钟后，加入VIP使成不同的终浓度，继续孵育20分钟，置冰上终止反应;其余步骤同上，进一步检测肥大细胞释放组胺和45Ca摄入量。

2 结果

2．1 VIP、CGRP对大鼠肥大细胞脱颗粒及组胺释放的影响 在倒置显微镜下观察，悬浮于HEPESTyrode缓冲液中的大鼠腹腔肥大细胞直径约15 μm，圆形或卵圆形，胞质内有丰富的细小颗粒，胞核明显。5×10－7mg/L VIP和所有浓度的CGRP均不能引起大鼠肥大细胞明显的形态变化;但5×10－7mol/L 48/80复合物、5×10－6mol/L 和 5×10－5mol/L的VIP均可引起肥大细胞脱颗粒变化，表现为细胞肿胀、颗粒融合、凸出、胞内出现空泡、颗粒释放至细胞周围等变化。

图1 VIP和CGRP对大鼠腹腔肥大细胞组胺释放的影响Fig．1 Effects of VIP and CGRP on histam ine release of RPMCs

同位素放射酶法检测大鼠腹腔肥大细胞释放组胺结果见图1。5×10－7mg/L 48/80复合物可引起大鼠腹腔肥大细胞明显释放组胺(与0浓度对照组相比，P＜0．01);5×10－6mol/L 的 VIP能诱导大鼠腹腔肥大细胞组胺释放率明显增加(与0浓度对照组相比，P ＜0．05)，且随浓度增大至5×10－5mol/L时，大鼠腹腔肥大细胞的组胺释放量进一步增加，呈剂量效应关系。所有浓度的CGRP不能引起大鼠腹腔肥大细胞组胺释放率明显改变(与0浓度对照组相比，各组 P ＞0．05)。

2．2 VIP、CGRP对大鼠肥大细胞45Ca摄取的影响5×10－7mg/L 48/80复合物可引起大鼠腹腔肥大细胞45Ca摄取明显增加(与0浓度对照组相比，P ＜0．01);5×10－6mol/L VIP可诱导大鼠腹腔肥大细胞45Ca摄取明显增加(与0浓度对照组相比，P＜0．01);且随浓度的增加45Ca摄取量也明显增加。各浓度CGRP组大鼠肥大细胞45Ca摄取量未见明显增加(与0浓度对照组相比，各组 P＞0．05)，见图 2。

图2 VIP和CGRP对大鼠腹腔肥大细胞45 Ca的影响Fig．2 Effects of VIP and CGRP on 45 Ca influx of RPMCs

图3 L-8-K对VIP诱导大鼠腹腔肥大细胞组胺释放的影响Fig．3 L-8-K interacting VIP on histam ine release of RPMCs

图4 L-8-K对VIP诱导大鼠腹腔肥大细胞45 Ca摄取的影响Fig．4 L-8-K interacting VIP on 45 Ca influx of RPMCs

2．3 L-8-K对CGRP诱导大鼠肥大细胞组胺释放、钙摄入的影响 5×10－6mg/L VIP受体抑制剂L-8-K对大鼠肥大细胞组胺释放、钙摄取无影响(与0浓度对照组相比，P 分别 ＞0．05)。5×10－6mg/L L-8-K处理大鼠肥大细胞后，其对5×10－6mol/L VIP和5×10－7mol/L VIP诱导的组胺释放和45Ca摄取的增加均无明显影响(与相应浓度的VIP组相比，P分别 ＞0．05)，见图3、4。

3 讨论

肥大细胞是哺乳动物体内组胺贮存的主要场所，而在肥大细胞中组胺几乎全部储存于其分泌颗粒中。因此，测量大鼠肥大细胞组胺的释放量，可以作为促颗粒释放物质促进肥大细胞脱颗粒的重要指标［4，5］。48/80 复合物是一种 N-甲基-p-甲氧苯乙胺-甲醛大分子聚合物，其具有强力的促进肥大细胞脱颗粒作用［6］。研究显示，48/80复合物分子中含有大量的阳性电荷，其不通过受体、直接作用于肥大细胞细胞膜上的G蛋白，通过一系列复杂的细胞内信号过程引起肥大细胞的活化、释放活性物质，引起生理及病理反应。本实验显示5×10－7mg/L 48/80复合物可引起大鼠腹腔肥大细胞中释放颗粒活性物质，促进钙摄入。

图1、2显示，5×10－6mol/L浓度的VIP可明显促进大鼠腹腔肥大细胞释放组胺和钙摄入，且随VIP浓度升高而升高;各浓度的CGRP则无促进肥大细胞释放组胺和钙摄取的作用。肥大细胞膜上是否具有神经多肽的受体、以及神经多肽是否通过受体作用于肥大细胞使其脱颗粒一直是人们争议的问题［3，4］。在组织中，一般神经多肽是在 pmol/L 水平上与受体结合而产生作用，然而神经多肽均在较高水平(μmol/L)促进肥大细胞脱颗粒［6］。研究认为，带有碱性阳离子氨基酸残基的神经多肽通过非受体依赖的方式，直接作用于肥大细胞膜上的G蛋白，经过G蛋白介导的磷脂酶C的活化，诱发钙离子的内流，导致肥大细胞内结构重排，进一步引起肥大细胞脱颗粒。在这一过程中，神经多肽分子中碱性氨基酸残基所带阳电荷数量、精氨酸残基数量、及多肽分子构型具有重要的作用［6，7］。VIP是由28个氨基酸残基组成的肽，其分子中具有6个碱性氨基酸残基、1个精氨酸残基、2个酸性氨基酸残基，共显示4个阳电荷;CGRP是37氨基酸残基的多肽，其分子中含有4个碱性氨基酸残基、2个精氨酸残基、2个酸性氨基酸残基，共显示2个阳电荷;本研究证实CGRP无诱导肥大细胞钙离子内流和脱颗粒的作用、表明神经多肽在促进大鼠肥大细胞功能活动时，除了需有阳电荷和精氨酸外，复杂的分子结构也是重要因素。

L-8-K是一种强力的VIP受体结合抑制剂，它可以抑制VIP引起的神经节细胞的功能活动［8］。本实验图3、4显示，L-8-K对VIP诱导的大鼠腹腔肥大细胞钙摄取、组胺释放均无影响，这进一步说明了VIP诱导的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒是非受体依赖的。

本文研究结果提示，VIP是通过非受体途径诱导大鼠腹腔肥大细胞内cAMP水平降低和钙内流增加，引起肥大细胞脱颗粒释放组胺，产生生物学效应;且具有剂量效应性;CGRP对大鼠腹腔肥大细胞无诱导活化作用。此结果显示，不同的神经多肽对大鼠肥大细胞的功能调节作用是不同的，展示了肥大细胞与神经系统联系的多样性。

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