陈登宇 陈峻崧 王 净 曹文虎 张洪义 杨翠萍 张云霞 窦 骏

(东南大学医学院病原生物学与免疫学系，南京 210009)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)约占卵巢癌的90%，是女性生殖器常见肿瘤，因肿瘤的侵袭和转移使患者五年生存期低［1］。锌指增强子结合蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)参与卵巢癌细胞生长转移和癌干细胞(Cancer stem cells，CSCs)表型的维持，成为靶向治疗 EOC 及 CSCs 的靶点［2，3］。本研究以 pSUPEREGFP1质粒为载体，构建靶向ZEB1的shRNA重组干扰质粒shZEB1，转染至人卵巢癌SKOV3细胞，G418筛选稳定转染细胞株，检测其抑制ZEB1表达的效率，进行功能性实验判定ZEB1下调后对上皮性卵巢癌细胞生物学性状如克隆形成能力、迁移力、裸鼠体内致瘤能力的影响，探讨ZEB1作为分子靶点用于卵巢癌靶向治疗的价值。

1 材料与方法

1．1 材料和试剂 人卵巢癌细胞株SKOV3，购自上海细胞所;ZEB1单克隆抗体，Santa cruz公司;BALB/c雌性裸鼠，扬州大学动物实验中心;RT-PCR试剂盒，北京天根生化科技有限公司;质粒小提及割胶纯化试剂盒，Axygen公司;限制性核酸内切酶HindⅢ、BglⅡ及EcoRⅠ，大连宝生物公司;T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA连接酶，大连宝生物公司;脂质体2000，Invitrogen公司;G418，Sigma公司;Trizol试剂，Invitrogen公司。

1．2 RT-PCR检测 SKOV3细胞中 ZEB1、miR-200c表达情况 引物设计参照GeneBank中人ZEB1、U6及β-actin序列，应用 Primer Premier5．0软件，于基因不同外显子上设计引物;miR-200c根据成熟体设计RT特异引物和PCR引物。SKOV3细胞抽提总RNA，RT-PCR扩增ZEB1，并半定量PCR扩增miR-200c，以U6作为内参，Quantity One软件进行灰度分析判定miR-200c表达量，见表1。

1．3 重组质粒的构建鉴定及转染 设计与合成靶向ZEB1基因的 siRNA，针对人 ZEB1编码基因ZEB1的cDNA序列(GenBank NM001128128)，根据pSUPER-EGFP1载体要求设计合成shRNA寡核苷酸模板，利用Dharmacon和Invitrogen公司的在线设计软件寻找候选ZEB1的RNAi靶点序列，由上海英骏生物技术有限公司合成。……