陈登宇 陈峻崧 王 净 曹文虎 张洪义 杨翠萍 张云霞 窦 骏

(东南大学医学院病原生物学与免疫学系，南京 210009)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)约占卵巢癌的90%，是女性生殖器常见肿瘤，因肿瘤的侵袭和转移使患者五年生存期低［1］。锌指增强子结合蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)参与卵巢癌细胞生长转移和癌干细胞(Cancer stem cells，CSCs)表型的维持，成为靶向治疗 EOC 及 CSCs 的靶点［2，3］。本研究以 pSUPEREGFP1质粒为载体，构建靶向ZEB1的shRNA重组干扰质粒shZEB1，转染至人卵巢癌SKOV3细胞，G418筛选稳定转染细胞株，检测其抑制ZEB1表达的效率，进行功能性实验判定ZEB1下调后对上皮性卵巢癌细胞生物学性状如克隆形成能力、迁移力、裸鼠体内致瘤能力的影响，探讨ZEB1作为分子靶点用于卵巢癌靶向治疗的价值。

1 材料与方法

1．1 材料和试剂 人卵巢癌细胞株SKOV3，购自上海细胞所;ZEB1单克隆抗体，Santa cruz公司;BALB/c雌性裸鼠，扬州大学动物实验中心;RT-PCR试剂盒，北京天根生化科技有限公司;质粒小提及割胶纯化试剂盒，Axygen公司;限制性核酸内切酶HindⅢ、BglⅡ及EcoRⅠ，大连宝生物公司;T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA连接酶，大连宝生物公司;脂质体2000，Invitrogen公司;G418，Sigma公司;Trizol试剂，Invitrogen公司。

1．2 RT-PCR检测 SKOV3细胞中 ZEB1、miR-200c表达情况 引物设计参照GeneBank中人ZEB1、U6及β-actin序列，应用 Primer Premier5．0软件，于基因不同外显子上设计引物;miR-200c根据成熟体设计RT特异引物和PCR引物。SKOV3细胞抽提总RNA，RT-PCR扩增ZEB1，并半定量PCR扩增miR-200c，以U6作为内参，Quantity One软件进行灰度分析判定miR-200c表达量，见表1。

1．3 重组质粒的构建鉴定及转染 设计与合成靶向ZEB1基因的 siRNA，针对人 ZEB1编码基因ZEB1的cDNA序列(GenBank NM001128128)，根据pSUPER-EGFP1载体要求设计合成shRNA寡核苷酸模板，利用Dharmacon和Invitrogen公司的在线设计软件寻找候选ZEB1的RNAi靶点序列，由上海英骏生物技术有限公司合成。单链两端包含保护碱基和BglⅡ和HindⅢ 酶切残基。scramble-siRNA序列质粒为不靶向任何基因的阴性对照序列。ZEB1-siRNA序列正义链:5'-GATCCCCAGGAAGAGGAGGAGGATAATTCAAGAGATTATCCTCCTCCTCTTCCTTTTTTGGAAA-3';反义链:5'-AGCTTTTCCAAAA AAGGAAGAGGAGGAGGATAATCTCTTGAATTATCC TCCTCCTCTTCCTGGG-3'。scramble-siRNA序列正义链:5'-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCA AGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAA-3';反义链:5'-AGCTTTTCCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGG G-3'。siRNA寡核苷酸链退火，双酶切质粒pSUPEREGFP1，将磷酸化 ZEB1-siRNA和回收质粒片段pSUPER-EGFP1质粒进行连接反应，4℃过夜，转化新鲜感受态细菌，挑取克隆提取质粒，构建质粒pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA(简称 shZEB1)，双酶切鉴定，重组质粒转染SKOV3细胞后有限稀释法及G418筛选稳转细胞株;同法构建和转染pSUPEREGFP1-scramble-shRNA(简称 sramble)质粒［4］。

表1 引物序列及产物大小一览表Tab．1 Primer sequence and product size

1．4 Western blot检测ZEB1蛋白表达 取野生型SKOV3及转染重组质粒SKOV3细胞各5×105，RIPA裂解液裂解细胞，离心后取上清获细胞裂解蛋白，Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，再按常规方法行 Western blot检测。

1．5 平板克隆形成试验 制备细胞悬液，按每板500个细胞接种于培养板中，培养板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%［5］。

1．6 划痕试验 将待观测细胞种于6孔板中，待生长融合成片后进行检测。用无菌枪头在孔中划线，使划线处无细胞生长;0、24、72小时，分别在显微镜相同位置下观察划线无细胞处的宽度，拍照记录。分析计算:愈合度=(1－某时点划痕宽度/原始划痕宽度)×100%，判定细胞迁移能力。

1．7 裸鼠致瘤试验 分别取5×106/100μl sh-ZEB1-SKOV3和scramble-SKOV3细胞悬液，背部皮下注射4～6周龄BALB/c雌性裸鼠，每组4只，监测各组小鼠肿瘤生长情况。致瘤肿块分离后，由苏木素伊红HE染色光镜下观察其病理形态。

1．8 统计学分析 t检验，P＜0．05有统计学意义。

2 结果

2．1 SKOV3细胞中ZEB1-mRNA表达 SKOV3细胞经总RNA提取、逆转录至cDNA并扩增ZEB1后，所得产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测，用AL2000 DNA maker作为分子量标志，电泳结果显示，SKOV3细胞中存在ZEB1基因的表达(图1A)。

2．2 重组质粒酶切鉴定 pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA、pSUPER-EGFP1-scramble-shRNA 与 pSU-PER-EGFP1空质粒，分别经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳。结果显示(图1B)，pSUPER-EGFP1质粒酶切产物，其片段约在237 bp处，构建质粒酶切产物片段约在291 bp处，均符合设计片段大小，表明shZEB1和scramble质粒构建成功，且进一步测序证实。

图1 shZEB1质粒构建及稳转SKOV3细胞株筛选Fig．1 shZEB1 p lasm id construction and screening stable transfection SKOV3 cells

2．3 阳性克隆筛选 以含800μg/ml G418初步筛选转染成功的细胞，随后在荧光显微镜下找出表达绿色荧光蛋白的阳性转染细胞克隆，以有限稀释法筛选得到阳性单个细胞克隆(图1C)，随后扩大培养获得稳转株。

2．4 SKOV3细胞中ZEB1蛋白表达 用稳定转染细胞提取总蛋白经 Western blot检测ZEB1蛋白表达水平。结果显示(图1D)，与野生型 SKOV3细胞相比，转染pSUPER-EGFP1-scramble质粒SKOV3细胞ZEB1蛋白表达与野生型基本相同，而转染sh-ZEB1质粒组细胞ZEB1蛋白表达显著下降。

2．5 平板克隆检测 培养10天，培养板中出现肉眼可见的克隆，终止培养后用吉姆萨染色，计数克隆形成率，shZEB1组较scramble组SKOV3细胞中克隆形成率降低，P ＜0．05(图2)。

2．6 细胞迁移力检测 0、24、72小时分别在显微镜相同位置下观察划线无细胞处竖线宽度，拍照记录后再行各无细胞区域宽度比较，判断愈合度。由图3A～D可见，shZEB1组较scramble组及野生型组SKOV3细胞中愈合度降低，经统计分析差异有显著性，P＜0．05。该结果显示，ZEB1低表达时 SKOV3细胞迁移力降低。

图2 平板克隆形成率Fig．2 Plate colony formation ratios

图3 划痕试验Fig．3 W ound healing assay

图4 半定量RT-PCR检测m iR-200c表达Fig．4 m iR-200c detected by sem i-quantitative RT-PCR

图5 体内不同SKOV3细胞裸鼠致瘤能力比较Fig．5 Comparison of the tumorigenicity of the different SKOV3 cells in the nudemice

图6 不同转染SKOV3对裸鼠致瘤肿块病理切片(HE染色，×400)Fig．6 Pathological section of different transfection SKOV3 tumor in nudemice(HE staining，×400)

2．7 miR-200c检测 RT-PCR检测miR-200c的表达(图4)，半定量RT-PCR分析shZEB1组较scramble组SKOV3细胞中miR-200c表达量增加，而miR-200c表达量增加会引起 SKOV3细胞迁移力降低［6］。

2．8 体内细胞致瘤能力比较 5周后观察不同转染组SKOV3细胞裸鼠致瘤情况，致瘤率比较结果显示shZEB1组较scramble组致瘤性下降(图5)。大体观察shZEB1 SKOV3肿块体积较小，生长缓慢;而scramble SKOV3肿块生长较快体积大，边缘粘连包膜不清，病理切片(图6)HE染色见肿块中明显核异质癌细胞，增生活跃，细胞核呈紫蓝色，细胞浆呈红色，细胞核浆比例增大，细胞核呈卵圆或不规则形，见有核仁。

3 讨论

EOC约占卵巢癌的90%，是女性常见肿瘤，其发病率在妇科恶性肿瘤中仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，但因肿瘤易转移复发，导致病死率占各类妇科肿瘤的首位［1］。因此，探明卵巢癌发生的起因，针对病因进行有针对性治疗，尤其抑制肿瘤的生长和转移清除CSCs才能从根本上治愈卵巢癌。ZEB1蛋白参与卵巢癌细胞生长转移和CSCs表型的维持，成为靶向治疗EOC及CSCs有价值的靶点，对于根治 EOC 及 CSCs具有重要意义［2，3］。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)可与特异性mRNA结合导致靶基因的降解，进而导致目的基因表达下调。利用载体在细胞内转录生成shRNA，是目前RNAi技术运用的主要手段，载体大多选用自身携带的RNA依赖性聚合酶Ⅲ的启动子，如U6或H1等启动shRNA编码序列，稳定持续地表达shRNA，经Dicer酶切产生siRNA，特异性地降解靶mRNA，使RNAi发挥作用时间更长、更稳定，从而达到有效抑制靶基因表达的目的［7］。本实验所选用的pSUPER-EGFP1质粒以新霉素抗性基因作为筛选标记，且在巨细胞病毒启动子CMV的驱动下可表达增强型绿色荧光蛋白EGFP，受紫外光源激发即可发出绿色荧光，可检测转染效率，以利选取稳定转染的单细胞克隆。为准确有效抑制靶基因表达，我们首先针对靶基因ZEB1编码基因mRNA链，参考相应文献及siRNA设计规则、评分标准，选取有效靶向ZEB1 mRNA的siRNA链，经BLAST比对证实其能特异性靶向ZEB1 mRNA。随后根据所用载体特点，在siRNA两端加上相应地酶切位点、保护碱基、茎环序列等，合成靶向ZEB1 mRNA的shRNA序列，并成功将其连接到载体质粒上。同时合成了不靶向任何mRNA的无关序列构建重组质粒及转染筛选出稳转株作为阴性对照。根据质粒的新霉素抗性和表达EGFP特点，筛选得到稳定转染的细胞，经 Western blot证实所构建的shZEB1干扰质粒可有效抑制ZEB1在SKOV3细胞中表达，这为下一步研究抑制ZEB1表达对卵巢癌SKOV3细胞生物学特征的改变奠定了基础。

ZEB1是上皮性钙粘蛋白(E-cadherin)转录抑制因子，具有典型的锌指结构，可以和靶基因E-cadherin启动区的E-box结合，抑制E-cadherin的转录表达导致细胞间粘附性降低、移动性增强。EOC中miR-200c与ZEB1构成双向负反馈环调节肿瘤的上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)进展。其中，ZEB1可抑制miR-200c的表达促进细胞上皮间质转化;而miR-200c表达增高又可反过来抑制靶基因ZEB1等的蛋白表达、降低癌细胞移动和生长能力。EOC临床分级越高，ZEB1蛋白表达越高，miR-200c越少，E-cadherin蛋白降低越显著，肿瘤多转移和复发、预后越差［6，8］。EOC 中 ZEB1 和ZEB2、snail及Slug均可以结合在E-cadherin启动子区的E-box上，抑制 E-cadherin基因的转录［9］。通过ZEB1基因沉默，可降低EOC及CSCs EMT和生长能力，从而降低转移性和致瘤性及耐药性、减少CSCs的抵抗性［10］。为进一步研究针对 EOC及CSCs EMT过程中的关键分子ZEB1进行靶向治疗的价值，我们构建了人ZEB1干扰质粒，用于ZEB1基因沉默后功能性实验研究。从本实验结果表明，shZEB1 SKOV3细胞内ZEB1表达被抑制，导致SKOV3细胞克隆形成能力、迁移力及致瘤性下降，miR-200c表达增高。这些结果显示，ZEB1可作为分子靶点用于肿瘤细胞靶向治疗，为EOC及CSCs的治疗提供理论和实验研究依据。

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4 Wang J，Zhou D D，Dou J et al．Effect of downregulated β-catenin on cell proliferative activity，the sensitivity to chemotherapy drugs and tumorigenicity of ovarian cancer cells［J］．Cell Mol Biol，2011;57(supp):OL1606-OL1613．

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7 范宝峰，刘晓梅，甘宜敏et al．应用RNA干扰抑制乙肝病毒X基因促HepG2细胞凋亡的作用［J］．中国免疫学杂志，2009;25(8):699-703．

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9 Dou J，Gu N．Biomarkersof Cancer Stem Cells［A］．In:Scatena R，Mordente A，Giardina B．Advance in Cancer Stem Cells［M］．Ist．USA:Springer，2011:45-68．

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