王金湖 王 梅 杨剑虹 王旭东 申娴娟 浦 江 鞠少卿

(江苏省太仓市第一人民医院检验科，太仓 215400)

B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是1999年发现的TNF超家族的成员之一［1］，BAFF具有特异性激活B淋巴细胞，促进B细胞增殖等功能。但新近研究发现BAFF过量表达会导致一些恶性肿瘤的发生，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)。因此我们利用LightCycler实时荧光定量PCR仪建立定量检测BAFFmRNA的方法，测定人NHL外周血中BAFF mRNA含量，探讨BAFF基因表达水平与NHL的相关性。

1 材料与方法

1．1 试剂与耗材

1．1．1 标本来源 20名健康献血者，来自本院体检中心体检健康者，其中女性13例，男性7例，年龄18～42岁，平均(25±7)岁。47例NHL患者，2007年8月～2008年8月来本院和南通大学附属医院的住院患者，其中男性27例，女性20例，年龄32～83岁，平均年龄(60±7)岁。

1．1．2 主要试剂与仪器 SuperScriptTMⅢ逆转录试剂盒(美国Fermentas公司);pGEM－T easy载体、质粒提取试剂盒、IPTG、dNTPS等(美国 Promega公司);胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司)。PTC－200 PCR扩增仪(美国MJ公司);LightCycler定量PCR扩增仪(德国Roche公司);U－0080D核酸紫外检测日本Hitachi公司);Dolphin－Doc凝胶成像系统(美国WEALTEC公司)。

1．2 实验方法

1．2．1 外周血中单个核细胞的分离 无菌采取新鲜血液3 ml，用EDTA抗凝。取淋巴细胞分离液(按与血液1∶2的比例)，加入到15 ml锥形离心管中，再将血液沿管壁轻轻铺到分离液上面，2 000 r/min离心20分钟，取血浆层与分层液交界处浑浊的灰白层(富含单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，1 500 r/min离心10分钟，最后弃去上清，－80℃冰箱保存。

1．2．2 引物设计 引物设计根据BAFF(注册号为AY129225)和内参GAPDH(注册号为NC_000012．10)全序列，应用 Beacon Designer 2．1软件，设计引物，由上海生工生物工程公司合成。BAFF－s 5'－CACGCCTTACTTCTTGCC－3'，BAFF－as 5'－CTTGGAGGATCGGACAG－3'，产物长度 102 bp;GAPDH－s 5'－CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT－3'，GAPDH－as 5'－AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC－3'，产物长度193 bp。

1．2．3 RNA的抽提与逆转录聚合酶反应(RTPCR)Trizol法提取细胞总RNA，核酸蛋白紫外分析仪检测RNA质量和浓度。……