温顺华，李 锋，黄庶冰，廖 威，陈丽梅，黄庶识*

（1.昆明理工大学 生物工程技术研究中心，云南 昆明 650500；2.广西科学院 生物物理实验室，广西 南宁 530007；3.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；4.广西大学，广西 南宁 530004；5.广西职业技术学院食品与生物技术系，广西 南宁 530226）

生物质能源已被认为是解决全球能源危机的最理想途径之一。作为生物质能源之一的燃料乙醇已在全球得到广泛的使用，但目前使用的乙醇主要是利用含淀粉作物和含糖作物（如小麦、玉米、甘蔗等）作为原料，通过发酵取得[1-2]。将粮食作物和经济作物用于生物乙醇的大规模生产，将会导致土地利用的扩张以及粮食价格的上涨，燃料乙醇的生产成本逐级提高，如果进一步发展乙醇生产，主要原料和土地供给空间客观上无法支撑燃料乙醇的扩张。因此农业生产废弃物（如玉米秸秆、木材等纤维素生物质）用于生物乙醇的生产被认为是解决能源危机的最可行策略[3-4]。但是，纤维素水解酶的系列开发、五碳糖发酵技术工程的菌株开发以及然纤维素结构中纤维素、半纤维素和木质素三者有效分离还存在重大技术瓶颈，成为妨碍纤维素酶法生物转化技术实用化的主要障碍[5]。

海洋藻类用于第三代生物质能源的生产具有比较优势[6]。与陆生植物相比，利用海洋藻类生产燃料乙醇在解决能源和环境问题的同时不会占用耕地，海洋藻类的光合转化率高，碳水化合物含量高，与陆生纤维素生物质相比，藻类几乎不含木质素，纤维素含量低，容易进行预处理[7-8]。美国能源部（DOE）的一份研究报告分析显示，每公顷海域年产大型海藻为59t（干重），其最高乙醇理论产量为干重的0.254%，基于这些数据估算，每公顷海域年最大乙醇产量为19000L[9]。这一数值比甘蔗的乙醇产量高了2倍，比玉米的乙醇产量高5倍[10]。但海藻成分较为复杂，如大型褐藻海带，其碳水化合物的主要成分为昆布多糖、海带淀粉、褐藻胶等多糖以及甘露醇等单糖，工业微生物无法直接利用这些多糖成分以及甘露醇来生产燃料乙醇，因此在藻类燃料乙醇的生产过程中需通过物理，化学或生物降解等方法来将多糖降解为微生物可直接利用的单糖[11]。传统的化学酸水解法降解海藻的多糖工艺，条件不易控制，并且裂解的产物分子量不均一，生产过程中产生大量的废气和废液，会带来环境污染；利用从微生物中分离提取的多糖降解酶，对海藻多糖降解为微生物可发酵糖组分，是一种经济、有效、无污染的方法。将海藻中多糖成份用于燃料乙醇生产的另一技术手段是通过基因工程方法来构建能够直接利用褐藻胶等海藻多糖来发酵生产燃料乙醇的基因工程菌，如2012年WARGACKI A J等[12]通过基因工程手段构建了一个能够直接利用褐藻胶生产乙醇的工程菌，能够直接将大型海藻的褐藻胶以及其他组分转化为乙醇，尽管如此，其技术仍然是基于褐藻胶裂解酶。

褐藻胶占褐藻总碳水化合物的50%左右，是细胞壁的主要组成成分和胞内基质的成分，是由单糖醛酸聚合的多糖，单糖主要有两类型，即β-（1→4）D-甘露醛酸（M）与α-（1→4）L-古罗糖醛酸（G）[13-15]。海藻酸盐裂解酶能够通过β消去基制将褐藻胶水解成为甘露糖醛酸和古罗糖醛酸[16]。前期研究结果显示，甘露糖醛酸和古罗糖醛酸可以被特定酵母利用并转化为乙醇。因此，海藻酸盐裂解酶在将褐藻胶水解成为微生物可发酵利用的单糖的同时，还能降低褐藻与水混合液的黏度，利于乙醇的发酵生产。褐藻胶裂解酶现在主要用于制备海藻原生质体，广泛运用于藻类的细胞工程、基因工程等领域[17-18]。此外褐藻胶裂解酶还被用于医药研究，其可用作药物酶治疗由铜绿假单胞菌感染造成的肺囊性纤维化症，另外还被用于制备具生物活性的海藻寡糖，近年来的研究表明，褐藻胶降解产物具有降血脂、抗肿瘤等作用[19-22]。但是，至今未有将褐藻胶裂解酶用于海藻生物质能源领域的相关报道。

在褐藻生物质能源的前期研究中，从腐烂的马尾藻中分离鉴定了一株产多种裂解酶的菌株Shewanella haliotis BP-1，实验结果显示，该菌株除了能够产海藻酸钠裂解酶以外，还能够产琼脂酶和昆布多糖酶，薄层层析（TLC）结果表明该菌株分泌的海藻酸钠裂解酶能够将海藻酸钠水解成为单糖。本文对菌株Shewanella haliotis BP-1的产海藻酸钠裂解酶条件进行初步优化，为后续的酶特性研究、海藻的糖化处理以及海藻水解醪液制取乙醇提供技术依据。

1 材料和方法

1.1 菌株

从腐烂的马尾藻（采集自北海涠洲岛）中分离纯化得到的海藻酸钠裂解酶产生菌，经理化和分子生物学鉴定为Shewanella haliotis BP-1，由本实验室保藏。

1.2 培养基

发酵培养基：（NH4）2SO40.5g，K2HPO41.05g，KH2PO40.45g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，海藻酸钠（阿拉丁，AR）0.5g，蒸馏水100mL，pH 7.0。种子培养基与发酵培养基成分相同，固体培养基中加入1.5%（w/v）的琼脂粉。

1.3 产酶条件优化

通过单因素试验来初步优化菌株Shewanella haliotis BP-1的产酶条件，试验过程中，在对应几种培养条件不变的情况下，通过改变单一培养条件或单一发酵培养基组份含量来进行。菌株Shewanella haliotis BP-1在液体培养基中复苏，划线培养并挑单菌落接种于种子培养基，37℃、160r/min培养24h作为菌种。除特殊说明外，基本培养条件是培养温度37℃，摇床转速160r/min，100mL三角瓶装液量为50mL。按1%接种量接入发酵培养基中培养72h后，发酵液4℃，12000r/min离心5min，取上清为酶液，-20℃保存，用于酶活测定。

1.4 酶活测定方法

酶活检测方法参照PREISS J等的[23]方法作适当修改。取2mL 0.1%（w/v）的海藻酸钠溶液（0.1mmol/L pH 7.5的Tris-HCl缓冲液配制），加入0.5mL酶液，在37℃水浴30min后沸水浴5min。冷却至室温后测波长235nm处的吸收值。在波长235nm处光密度每分钟增加0.001定义为1个酶活力单位（U）。

1.5 蛋白含量测定

蛋白含量测定按Bradford方法[24]。

2 结果与讨论

2.1 发酵温度对产酶的影响

温度是影响菌株生长代谢的重要环境因子，分别在25℃、28℃、35℃、37℃的条件下，对菌株BP-1在发酵培养基中进行发酵培养72h，检测发酵液中海藻酸盐裂解酶活力。结果（图1）显示，在28℃～35℃温度范围内，菌株具有较高产酶能力，35℃产酶能力最大，当培养温度低于28℃或高于35℃时，菌株的产酶能力大幅降低。

图1 培养温度对产酶的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on alginate lyase production

2.2 初始pH值对产酶的影响

用氢氧化钾调节培养基初始pH值，对菌株BP-1发酵培养72h，检测发酵液中酶活力。结果（图2）表明，该菌株在pH7.5～8.0的范围内具有较高的产酶能力，最适产酶pH值为8.0，高于8.0该菌株产酶能力大幅下降。

图2 初始pH值对产酶的影响Fig.2 Effect of initial pH value on alginate lyase production

2.3 不同浓度碳源对产酶的影响

试验过程中发现菌株Shewanella haliotis BP-1只有以海藻酸钠为碳源时才能产生海藻酸钠裂解酶，表明海藻酸钠是该菌株产海藻酸钠裂解酶的诱导物，对酶的产生至关重要。以海藻酸钠作为唯一碳源，使用不同海藻酸钠浓度的培养基分别对菌株进行发酵培养72h。当海藻酸钠浓度为0.4%（w/v）时菌株的产酶能力最强，浓度大于0.4%（w/v）时菌株的产酶能力呈下降趋势（图3）。

图3 海藻酸钠浓度对产酶的影响Fig.3 Effect of the sodium alginate on alginate lyase production

2.4 氮源对产酶的影响

分别用0.5%（w/v）的酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸钠、氯化铵、硫酸铵作为氮源进行菌株的发酵培养，考查不同氮源对产酶的影响。当以牛内膏和酵母粉作为氮源时菌株不产海藻酸钠裂解酶，以硫酸铵作为氮源时菌的产酶能力最高（图4A）。随后以硫酸铵作为氮源，考查不同氮源浓度对菌株产酶的影响，结果见图4B。当硫酸铵浓度为0.6%（w/v）时菌株产酶能力最大，因此以0.6%（w/v）的硫酸铵做为产酶的最适氮源浓度。

2.5 无机盐对产酶的影响

2.5.1 NaCl对产酶的影响

由于该菌株筛选自海洋，对盐度的依赖是海洋微生物的典型特征。推测NaCl浓度对产酶的影响较大。采用含不同浓度NaCl的培养基对菌株进行发酵培养，结果见图5，NaCl浓度在1%～2%（w/v）的范围内菌株产酶能力较高，当NaCl浓度为2%（w/v）时菌株的产酶能力最为理想，高于2%（w/v）时菌株的产酶能力急剧降低。

图4 氮源对产酶的影响Fig.4 Effect of nitrogen source on alginate lyase production

图5 NaCl浓度对产酶的影响Fig.5 Effect of the NaCl on alginate lyase production

2.5.2 Mg2+、Fe2+对产酶的影响

配制含不同浓度MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O的发酵培养基对菌株进行发酵培养，研究不同Mg2+和Fe2+浓度对产酶的影响，结果见图6A，在不含Mg2+的培养基中几乎无海藻酸钠裂解酶活性，而当MgSO4·7H2O浓度为0.2%（w/v）时菌株的产酶能力最强。Fe2+浓度的试验（图6B）表明，高浓度的Fe2+会抑制菌株的产酶能力，但当FeSO4·7H2O为0.001%（w/v）时菌株具备最佳产酶能力。

2.6 接种量对产酶的影响

图6 Mg2+和Fe2+浓度对产酶的影响Fig.6 Effect of Mg2+and Fe2+on alginate lyase production

发酵培养基中分别按0.5%（v/v）、1%（v/v）、2%（v/v）、4%（v/v）、6%（v/v）、8%（v/v）的接种量接入菌种进行发酵72h，结果见图7，当接种量为1%时产酶量最大，高于1%时，随接种量的增加菌体产酶量明显下降。因此最适的产酶接种量为1%。

图7 接种量对产酶的影响Fig.7 Effect of inoculum on alginate lyase production

2.7 装液量对产酶的影响

采用500mL三角瓶，分别装入50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL不同体积的培养基，接种菌株后培养72h，结果见图8。随着装液量的增加，菌体的产酶量随之增加，当装量超过200mL时继续增大装液量，菌体的产酶量会随之下降，表明菌体的产酶量会受溶氧量的影响。装量为200mL时菌体的产酶量最大，适于批量发酵。

2.8 摇床转速对产酶的影响

摇床转速与发酵液中的溶氧量有关，这里研究了不同转速对菌株产酶的影响，结果见图9，当转速为200r/min时菌体的产酶量最大，转速大于200r/min时菌株的产酶能力急剧降低，表明该菌株可能是兼性厌氧菌。

图8 装液量对产酶的影响Fig.8 Effect of shaking flask volume on alginate lyase production

图9 摇床转速对产酶的影响Fig.9 Effect of rotation speed on alginate lyase production

2.9 K+浓度对产酶的影响

以上述优化后的条件改变K+浓度来对菌株进行发酵，结果见图10。试验表明在3种K+浓度组合中，在1.05%（w/v）K2HPO4加上0.45%（w/v）KH2PO4的K+配方培养菌株时，菌株的产酶能力最强。因此产酶培养基的K+配方初步确定为1.05%（w/v）K2HPO4加0.45%（w/v）KH2PO4。

图10 K+浓度对产酶的影响Fig.10 Effect of K+on alginate lyase production

2.10 优化后菌体的产酶曲线

根据上述研究确定了菌株Shewanella haliotis BP-1产海藻酸钠裂解酶的最佳产酶条件。最佳培养条件为：pH 8.0，温度35℃，摇床转速200r/min，接种量1%（v/v），装量为500mL三角瓶装200mL。优化后的培养基组成为K2HPO41.05%，KH2PO40.45%，MgSO4·7H2O 0.2%，FeSO4·7H2O 0.001%，硫酸铵0.6%，NaCl 2%，海藻酸钠0.4%。在此条件下对菌株进行发酵培养120h，每12h取样1次，测发酵液中酶活性，蛋白量和菌浓度，计算酶的比活力，结果见图11。培养24h后培养基中酶活性达到较大值（28.1U/mL），随培养时间的延长，发酵液酶活性在培养48h后达到最大值30.4U/mL，随后缓慢降低，但发酵液中的蛋白浓度随发酵时间的延长而增加，而细菌培养24h后即达到稳定期，36h后为衰退期。通过比活力计算发现在24h时酶的比活力最大为0.92U/μg。分析发酵液酶活性在24h至60h相对稳定的原因是随着培养时间的增加培养基的pH值升高（实验发现在培养24h后培养基的pH值升高至8.5），从而使酶的稳定性降低，部份酶失活，菌株为了保持生长需要持续分泌海藻酸盐裂解酶来将海藻酸钠水解，因此这也可能是发酵液中蛋白浓度持续升高的原因，培养基中蛋白浓度升高的另一原因可能是菌体的死亡裂解导致的。

图11 优化后菌株BP-1的产酶曲线Fig.11 Time course of alginate lyase production by strain BP-1 after optimization

3 结论

本实验优化了产海藻酸钠裂解酶菌株Shewanella haliotis BP-1的产酶条件，优化后菌株的最佳产酶培养基组成为K2HPO41.05%，KH2PO40.45%，MgSO4·7H2O 0.2%，FeSO4·7H2O 0.001%，硫酸铵0.6%，NaCl 2%，海藻酸钠0.4%。最佳培养条件为pH 8.0，温度35℃，摇床转速200r/min，接种量1%（v/v），装量为500mL三角瓶装200mL。在产酶最适培养基和最适培养条件下菌株Shewanella haliotis BP-1培养24h后即可达到隐定期，此时培养液中酶的比活力最高。随后随着培养时间的延长，培养液中酶的活性变化不大，保持在30U/mL左右。由于该菌株可能为兼性厌氧菌，因此培养液中的溶氧量对菌株的产酶影响较大。严格控制培养液中溶氧量有助于进一步提高菌株的产酶能力，提高发酵液中的酶量。另外，该菌株的产酶发酵周期短，这是该菌株产酶的优势，利于工业发酵，可极大的降低生产成本。同时查《Bergey’s manual of Systematic Bacteriology》（2nd）[25]和网站http://www.bacterio.cict.fr/s/shewanella.html发现该菌株也是Shewanella属中第一个筛选得到的能产海藻酸钠裂解酶的菌株。

[1]PASCALE C.Feasibility of producing bio-ethanol from waste residues:a Canadian perspective:feasibility of producing bio-ethanol from waste residues in Canada[J].Resour Conserv Recy,2007,50(3):211-230.

[2]BOTHAST R,SCHLICHER M.Biotechnological processes for conversion of corn into ethanol[J].Appl Microb Biotechnol,2005,67(1):19-25.

[3]LU X,ZHANG Y,ANGELIDAKI I.Optimization of H2SO4catalyzed hydrothermal pretreatment of rapeseed straw for bioconversion to ethanol:focusing on pretreatment at high solids content[J].Bioresource Technol,2009,100(12):3048-3053.

[4]陈姍姍，潘诗翰，董 蓉，等.褐藻燃料乙醇研究进展及其应用前景[J].中国酿造，2011（4）：11-15.

[5]BERNDES G,HOOGWIJK M,BROEK R VAN DEN.The contribution of biomass in the future global energy supply:a review of 17 studies[J].Biomass Bioenerg,2003,25(1):1-28.

[6]CHIARAMONTI D.Bioethanol:role and production technologies[J].Impr Crop Plant Ind End Use,2007:209-251.

[7]SHILTON AN,POWELL N,MARA DD,et al.Solar-powered aeration and disinfection,anaerobic co-digestion,biological CO2scrubbing and biofuel production:the energy and carbon management opportunities of waste stabilization ponds[J].Water Sci Technol,2008,58(1):253-258.

[8]MI QUANLING,WANG RUITING,ZHANG XUEJING.Exploitation and utilization of bio-energy[J].China Forest Prod Ind,2010,37(4):51-53.

[9]ROESIJADE G.,JONES SB,SNOWDEN-SWAN LJ,et al.,Macroalgae as a biomass feedstock:A preliminary analysis[M].Prepared for the U.S.Department of Energy under contract DE-AC05-76RL01830 by Pacific Northwest National Laboratory.2010.

[10]CHRIS S,HEATHER Y,CAROLINE T,et al.Feedstocks for lignocellulosic biofuels[J].Science,2010,329(5993):790-792.

[11]JANG JS,CHO YK,JEONG GT,et al.Optimization of saccharification and ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation(SSF)from seaweed,Saccharina japonica[J].Bioproc Biosyst Eng,2012,35(1-2):11-18.

[12]WARGACKI A J,LEONARD E,WIN M N,REGITSKY D D,SANTOS C N S,KIM P B,COOPER S R,RAISNER R M,HERMAN A,SIVITZ A B,LAKSHMANASWAMY A,KASHIYAMA Y,BAKER D,YOSHIKUNI Y.An Engineered microbial platform for direct biofuel productionfrombrownmacroalgae[J].Science,2012,335(6066):308-313.

[13]TANG JC,TANIGUCHI H,CHU H,et al,Isolation and characterization of alginate-degrading bacteria for disposal of seaweed wastes[J].Lett Appl Microbiol,2009,48(1):38-43.

[14]KLOAREG B,QUATRANO RS.Structure of the cell walls of marine algae and ecophysiological functions of the matrix polysaccharides[J].Oceanogr Mar Biol Ann Rev,1988,26(26):259-315.

[15]CAO LIXIANG,XIE LUJING,XUE XIAOLI,et al.Purification and characterization of alginate lyase fromStreptomycesspecies strain A5 Isolated from banana rhizosphere[J].J Agric Food Chem,2007,55(13),5113-5117.

[16]LI JW,SONG S,LI CB,et al.Purification and characterization of a bifunctional alginate lyase fromPseudoalteromonassp.SM0524[J].Marine Drug,2011,9:109-123.

[17]BOYEN C,BERTHEAU Y,BARBEYRON T,et al.Preparation of guluronate lyase fromPseudomonas alginovorafor protoplast isolation in Laminaria[J].Enzyme Microb Technol,1990,12:885-890

[18]管 斌，倪雪朋，李悦明，等.海藻多糖降解酶的研究进展[J].中国酿造，2010（9）：8-12.

[19]ALKAWASH MA,SOOTHILL JS,SCHILLER NL.Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoidPseudomonas aeruginosain biofilms[J].APMIS,2006,114:131-8

[20]OTTERLEI M,SANDAN A,SKJ?K-BRAEK G,et al.Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate[J].J Immunother,1991,10:286-91

[21]OTTERLEI M,SUNDAN A,SKJÅK-BRAEK G,et al.Similar mechanisms of action of defined polysaccharides and lipo polysaccharides:characterization of binding and tumor necrosis factor α induction[J].Infect Immun,1993,61:1917-1925.

[22]STEVAN FR,OLIVEIRA MBM,NOSEDA MD,et al.Cytotoxic effects against HeLa cells of polysaccharides from seaweeds[J].J Submicrosc Cytol Pathol,2001,33:477-484.

[23]PREISS J,ASHWELL G.Alginic acid metabolism in bacteria.I.Enzymatic formation of unsaturated oligosaccharides and 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid[J].J Biol Chem,1962,237(2):309-316.

[24]BRADFORD MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[25]BOWMAN J P.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.2nd[M].New York:Springer,2005:480-491.