刘晓明 尼秀媚 刘永光 马晋芳 林亚君

（潍坊科技学院 山东寿光 262700）

Kaiser等［1］1968年首次报道分离自梭菌（Clostridium alginolyticum）的胞外褐藻胶裂解酶，目前，科研工作者在褐藻胶裂解酶的研究领域取得大量成果，例如，藻酸双脂钠（PPS）、海立特等海洋药物的问世极大地鼓舞了科学工作者向海洋要宝的信心。褐藻胶作为源自褐藻植物细胞壁的水溶性酸性多糖，在农业、食品、医药和化工等领域具有广泛的应用价值［2］。

海藻肥料作为新一代天然海洋生物肥料，具有多种高活性成分和营养元素，有明显的增产效果和极强的抗逆作用，在环境保护、经济效益方面的表现突出［3］。目前，比较常见的褐藻胶降解糖化方法包括稀酸加热法、碱降解法、氧化降解法、直接加热法、辐射法和生物方法［4］。生物方法具有高效、预处理简单和无污染等优点，是褐藻胶糖化的必 要手段［5-7］。

微生物发酵除了能产生高营养价值的海藻肥外，其产生的褐藻胶裂解酶酶解产物褐藻寡糖还能抗凝血、降血糖血脂［8-9］、抗肿瘤［10–11］、清除自由基［12］、促进肠道双歧杆菌生长［13］，具有较高的食用和药用价值。因此,筛选和发现高效的褐藻胶降解菌,对其褐藻胶裂解酶进行研究已逐渐成为微生物应用领域的研究热点［5-6］。

褐藻胶裂解酶来源广泛，例如，海藻类、海洋软体动物、棘皮动物、海洋细菌、陆生真菌及土壤细菌等［14］，微生物来源主要有假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）［15］等。

菌株A78 筛选自腐烂的海带，能在48 h 内高效降解海带块，具有较强的褐藻胶降解功能和应用潜能。对菌株A78 的鉴定及其所产褐藻胶裂解酶的特性进行研究，为该类微生物资源降解褐藻胶及褐藻生物能源转化提供数据支持。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与培养基

菌株：从海带中分离纯化出的海洋细菌A78。

试剂：DNS 试剂、褐藻酸钠（化学纯，国药）、蛋白胨、琼脂、酵母膏、磷酸高铁（分析纯，国药）、2×PCR MasterMix（杭州宝赛）。

培养基：2216E 培养基（添加浓度为0.1 g／L磷酸高铁）、LB 液体培养基（北京陆桥）。

缓冲液：不同pH 值的缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH=4～8、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH=9～10。

1.2 引物合成 菌株16S rDNA 序列扩增引物选用27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′ 和1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司（上海生工）合成。

1.3 方法

1.3.1 褐藻胶酶活性透明圈验证 在2216E 培养基中添加20 g／L 的褐藻酸钠溶液和0.1 g／L的磷酸铁溶液，高压灭菌，冷却至室温后，将海洋细菌A78 接种至2216E 培养基中30℃培养5～7 d。加入10%的氯化钙，静置30 min，观察是否有透明圈产生。

1.3.2 PCR 反应与测序 以27F 和1541R 为引物，以A78 菌株总DNA 为模板，通过PCR 扩增得到目的基因。PCR 反应体系为40 μL，其中含1 μL 引物27F、1 μL 引物1541R、2 μL DNA 模板、20 μL 2×PCR Master Mix 及16 μL ddH2O。反应条件为94℃5 min，94℃1 min，55℃1 min，72℃1.5 min，30 个循环，72℃3 min。PCR 产物胶回收后送至测序公司（上海生工）进行测序，序列在NCBI 数据库进行比对。

1.3.3 褐藻胶裂解酶活性测定方法 本实验采用DNS 法（比色法）测褐藻胶裂解酶的活性［12-13］。

1.3.4 褐藻胶酶最适温度与最适pH 值的测定本实验设置了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃共8 个温度梯度，pH 值为4、5、6、7、8、9和10 共7 个梯度，分别使用了磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液进行配制。

1.3.5 不同浓度诱导物对菌株产酶的影响 50 mL LB 培养基中分别加入0.5%、1%、1.5%的褐藻酸钠和等大的海带块，接入相同量的菌液，30℃培养48 h，观察海带降解情况并检测褐藻胶酶活性判断诱导物对菌株A78 产酶的影响。

2 结果与讨论

2.1 海洋细菌A78 种类鉴定

2.1.1 海洋细菌A78 产褐藻胶酶确认 细菌A78 在2216E 培养基中培养5 d 后，菌落呈现圆形，乳白色，菌落较大，表面光滑，边缘透明。添加10%的氯化钙，菌落周围能产生明显的透明圈，说明菌株A78 菌能产生褐藻胶裂解酶。

2.1.2 海洋细菌A78 的生理生化特征 对海洋细菌A78 进行23 项理化指标测定，结果如表1所示。由细菌A78 生理生化特性可知，海洋细菌A78 可将蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖等作为唯一碳源，却不能将麦芽糖、山梨醇、某些氨基酸等作为碳源，这与已报道的交替假单胞菌属细菌的生理生化结果比较相似。

表1 海洋细菌A78 生理生化特性

2.1.3 海洋细菌A78 的16S rDNA 序列鉴定 利用引物27F 与1541R 扩增菌株A78 部分16S rDNA 序列，得到1 500 bp 左右的PCR 产物，测序结果在NCBI 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.govBlast/）对比，获取与其相似度较高的标准菌株序列，比对结果显示A78 菌株与假交替单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）的相似度达到99%以上，亲缘关系最近，因此菌株A78 初步鉴定为假交替单胞菌。

2.2 海洋细菌A78 的褐藻胶裂解酶的诱导培养将海洋细菌A78 置于50 mL LB 肉汤培养基中，在LB 肉汤培养基中分别添加0.5%、1%、1.5%的褐藻酸钠和海带。从图1可观察到，加入1%褐藻酸钠的LB 培养基中的2 块海带有一块已经完全降解，另一块也接近降解。在添加0.5%及1.5%褐藻酸钠的培养基中，海带只进行了初步降解，说明1%褐藻酸钠诱导下该菌株产生的褐藻胶酶数量较大，太高或太低浓度的褐藻酸钠都不利于诱导菌株A78 产酶。

图1 加入不同浓度褐藻酸钠诱导海带块降解情况

分别在上清液与菌体分离、未分离的情况下检测褐藻胶酶活性，结果1%褐藻酸钠诱导下，上清液加菌体褐藻胶酶活最高。单独上清液或菌体酶活都比较低，说明该菌所产褐藻胶裂解酶在上清液中与菌体上都存在；1%褐藻酸钠诱导下酶活最高，说明浓度适中的诱导物能明显提高菌株A78 褐藻胶酶产量。未加诱导物与加入0.5%褐藻酸钠、1.5%褐藻酸钠及海带块的褐藻胶裂解酶酶活没有明显差距，说明诱导物对菌株A78 产酶有重要影响，且浓度是关键因素；具体数据见图2。

图2 A78 菌株在不同诱导物诱导作用下的褐藻胶裂解酶活性

2.3 不同温度与pH 值对褐藻胶裂解酶活性影响

2.3.1 不同温度对褐藻胶裂解酶活性影响 温度是影响酶活性的重要因素。本研究设置了20℃～55℃之间8 个温度梯度，研究了菌株A78 所产褐藻胶裂解酶酶活与温度之间的关系。通过图3可推断，褐藻胶裂解酶的活性在20℃～25℃之间活性接近零，但是在温度升高至30℃的过程中，酶活快速增长，30℃时已达到酶活的最大值82.6 U／mL；当温度继续升高至40℃，酶活又逐渐降低；当温度达到45℃时，酶活有所回升，但依旧较低；当温度升高到55℃时，酶活接近零。

图3 不同温度对菌株A78 褐藻胶裂解酶活性影响

2.3.2 不同pH 值对褐藻胶裂解酶活性的影响不同的pH 值对褐藻胶裂解酶的活性有着很大的影响，过酸或过碱都会破坏酶的结构，从而影响酶的活性［16］。设置pH 值为4～10 之间的7 个梯度，在30℃培养菌株A78。根据图4可得出，当pH 值从4 变至5 时，褐藻胶裂解酶的活性明显上升，在pH 值为5～5.5 之间活性最高，可达到70 U／mL左右。当pH 值由5 达到7 时，褐藻胶裂解酶的活性接近零。说明菌株A78 所产的褐藻胶裂解酶适合偏酸的条件下发挥酶活。

图4 不同pH 值对菌株A78 褐藻胶裂解酶活性影响

2.3.3 培养时间对细菌A78 褐藻胶裂解酶活性的影响 在1%褐藻酸钠诱导的LB 液体培养基中，每隔4 h 检测一次褐藻胶酶活性，通过图5可得出，在培养4 h 之后，发酵液中褐藻胶裂解酶的活性大约为75 U／mL；12 h 以内酶活基本不变；但是在培养12 h 之后，褐藻胶酶活性急剧下降，至32 h 达到最低点，褐藻胶裂解酶的活性接近零。32 h 后，酶活又有所升高，在培养52 h 之后，酶活再次降低。

图5 不同细菌培养时间对褐藻胶裂解酶活性影响

出现该发酵过程可能的原因是，菌株A78 在发酵前期迅速合成褐藻胶裂解酶，酶的初步产量较高。在12 h 以后，大量分泌到上清液中的褐藻胶酶与底物充分作用，消耗巨大，因此，褐藻胶酶活力逐渐降低。在32 h 后，培养基中的褐藻酸钠被逐渐消耗殆尽，褐藻胶裂解酶的消耗量降低，因此褐藻胶酶活力又有所上升。菌株A78 所产生的褐藻胶裂解酶是诱导酶，在发酵过程中边产生边消耗，因此，发酵过程中酶活波动较大。

3 结论

菌株A78 分离自日本海域的腐烂海带，褐藻胶酶筛选平板结果表明菌株A78 具有褐藻胶酶活性。通过生理生化特征及16S rDNA 序列分析对其进行鉴定［15，17］，初步鉴定结果为假交替单胞菌。

适当浓度的诱导物能提高菌株A78 的褐藻胶酶产量，但褐藻胶酶活力与已报道的菌株相比没有显著优势［16］，而在海带块降解实验中，本菌株能在48 h 内将海带块降解，优势明显。在酶活检测过程中，上清液或菌体中均能检测到酶活，而上清液+菌体酶活最高，该结果表明，菌株A78 所产的褐藻胶裂解酶在上清液和菌体表面均有分布，上清液与菌体表面的褐藻胶裂解酶可能是1 种或多种褐藻胶裂解酶，通过协同作用达到高效降解褐藻胶的效果。

温度实验中，菌株A78 褐藻胶酶活力峰有2个，其中一个主峰在30℃左右，另一个酶活峰出现在45℃左右；pH 值实验中，酶活力峰有2 个，其中一个主峰是在pH=5 左右，另一个小的酶活峰在pH=9 左右。出现这种结果可能是该菌含有1个以上褐藻胶裂解酶基因，而2 个基因表达的酶的量与特性有较大区别，但要清楚的确证，还需要进行后续的菌株A78 褐藻胶裂解酶的分离纯化，并进行纯化酶的特性研究。

本研究初步探究出由海洋细菌A78 产的褐藻胶裂解酶与底物反应的最适pH 值、温度及细菌培养的最适时间，发现当温度为30℃、pH 值为5～5.5、培养时间为4～12 h 时褐藻胶裂解酶的活性最高。同时，还发现A78 细菌在1%褐藻酸钠的诱导下才能产出大量的褐藻胶裂解酶，过高或过低的诱导物浓度都不利于该菌产酶。研究结果对假交替单胞菌的开发应用提供研究基础和数据支持。