林 谦 金 玉 周进苏 陆 芬 李晓乐 李 玫 段招军

轮状病毒(HRV)、人杯状病毒(HuCV)、星状病毒(AstV)和肠道腺病毒(AdV)是婴幼儿病毒性腹泻的主要病原[1]。在中国开展的多项系统监测显示，HRV感染占中国住院腹泻患儿的26%，社区腹泻患儿的10%，是住院腹泻患儿的首要病原[2]。HuCV包括诺如病毒(NV) 和札如病毒(SV)，NV在人群中普遍易感，常引起腹泻病的暴发流行，美国和日本都暴发过大规模的NV胃肠炎[3～6]；SV主要引起5岁以下儿童的散发感染。中国自1995 年方肇寅等[7]在婴幼儿腹泻粪便标本中首次检测出HuCV之后，北京、广州和兰州等地区也陆续检出HuCV，感染率仅次于HRV[8～11]。AstV亦是引起婴幼儿急性腹泻的主要病原[12,13]，中国还没有暴发流行的相关报道，但在北京、天津和郑州等地区有少量散发感染的报道[14～16]。1995年，程绪杰等[17]首次从中国腹泻患儿粪便中检测到AdV；2004年，曹卫中等[18]报道某幼儿园由AdV感染引起的暴发性腹泻。目前中国对AdV的研究相对较少。近年，兰州、广州、河北、南京和长春等地相继报道上述4种病毒在婴幼儿腹泻中的感染情况[19～23]。本研究收集2009年7月至2010年6月南京医科大学附属南京儿童医院(我院)5岁以下腹泻患儿的粪便标本，对以上4种病毒进行检测，以了解上述4种病毒在我院的流行特征，为病毒性腹泻的防治提供基础数据和理论依据。

1 方法

1.1 标本纳入标准 指派专门人员固定于每周三、五上午8：00～12：00对我院消化科门诊就诊的患儿进行登记，并留取初次就诊、病程≤3 d、每日大便次数增加≥3次、大便性状发生改变(包括稀水样、蛋花汤样或稀糊样)、粪便镜检WBC≤5·HP-1的5岁以下腹泻患儿的粪便标本。

1.2 标本排除标准 在纳入标本中排除黏液便、脓血便，确诊为其他疾病(如肺炎、幼儿急疹等)患儿的粪便标本。

1.3 标本收集 标本采集后立即于-20℃保存，3 d内移至-80℃冰箱保存，每3个月由专人用冰盒外充液氮送至北京中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肠道病毒室进行统一检测。

1.4 月龄分组 因病毒性腹泻以2岁以下儿童为主要感染人群，为更好地观察该人群的发病率，大多数文献均将24月龄以内的患儿以每6个月为一组作为观察对象[19,21]，2岁以上的患儿因感染人数较少,故各文献分组标准各异。本研究以每6个月为一年龄观察组，30月龄后以48月龄为界分为两组。根据上述标准，本研究将病毒性腹泻患儿分为<6月龄，～12月龄，～18月龄，～24月龄，～30月龄，～48月龄和～59月龄组。

1.5 主要材料和试剂 Taq DNA聚合酶、AMV逆转录酶和随机引物购自美国Promega公司，SuperscriptⅡ或Ⅲ反转录酶(5×first strand buffer ，0.1 mmol·L-1DTT)购自美国Invitrigen公司，RNA酶抑制剂(RNasin)、DNA Maker DL 100和2 000购自宝生物工程(大连)有限公司，病毒核酸提取试剂盒购自Geneaid公司，dNTPs(dGTP/dATP/dCTP/dTTP)购自sbs赛百盛公司， HRV ELISA试剂盒(IDEIATM Rotavirus试剂盒)购自丹麦Dako Cytomation公司；QIAGEN Quick Gel Extraction购自德国Promega公司。

1.6 病毒检测 A组HRV检测采用ELISA试剂盒，应用Trizol提取HRV RNA，逆转录合成病毒cDNA，采用巢式逆转录聚合酶联反应(Nested RT-PCR)方法对HRV阳性标本进行G血清型和P基因型分型。逆转录试剂盒及PCR试剂盒均按说明书操作。采用RT-PCR法检测NV、SV和AstV，采用PCR法检测AdV。引物见表1，电泳图见图1。

表1 用于HRV、HuCV、AstV和AdV的寡聚核苷酸引物

Notes 1)HRV: G/P typing; HuCV, AstV and AdeV: polarity

2 结果

2.1 一般情况 2009年7月至2010年6月我院消化科就诊的考虑病毒性腹泻的患儿2 958例。本研究共收集符合纳入和排除标准的粪便标本300份，其中男188例，女112例。年龄1～59月龄，平均(10.5±9.2)月龄。

2.2 HRV检测、分型及流行病学特点 HRV阳性113/300份，阳性率37.7%。对113份HRV阳性标本进行G血清型和P基因型鉴定。G血清型结果：G1型2份(1.8%)，G2型10份(8.8%)，G3型44份(38.9%)，G9型1份(0.9%)，G2+G3型2份(1.8%)，未能分型54份(47.8%)，未发现G4和G8型；P基因型结果：P[4]型19份(16.8%)，P[8]型38份(33.6%)，未能分型56份(49.6%)，未发现P[6]、P[9]和P[10]型。在G血清型和P基因型组合方面，以G3P[8]为主(15.9%，18/113)，其次是G3P[4](9.7%，11/113)和G2P[8](3.5%，4/113)，G2P[4]、G1P[8]和G2+G3P[8]各1份(表2)。

表2 2009至2010年HRV G血清型与P基因型组合(n)

Tab 2 Distribution of rotaviruses G-cerotypes and P-genotypes from 2009 to 2010(n)

TypesNontypedP[4]P[8]TotalNontyped3371454G11012G251410G315111844G2+G31012G91001Total561938113

HRV阳性患儿年龄分布在1～48月龄，平均(10.5±9.2)月龄。～12月龄组HRV阳性率最高，为43.4%(49/113),与其他月龄组相比差异有统计学意义(χ2=31.793，P=0.000)；其次是<6月龄组(28.3%，32/113)、～18月龄组(17.7%，20/113)和～24月龄组(8.0%，9/113)；～48月龄组HRV阳性率最低(0.9%，1/113) (表3)。HRV感染高峰季节为2009年10月至2010年1月，占60.2%(68/113)，与其他月份相比差异有统计学意义(χ2=28.599，P=0.000) (图2)。

2.3 HuCV检测、分型及流行病学特点 HuCV阳性71/300份(23.7%)，其中NV 67份(22.3%)，SV 4份(1.3%)。

HuCV感染全年均可发生，于2009年8月出现一个小高峰(图3)，但与其他月份相比差异无统计学意义(χ2= 0.088，P=0.883)。HuCV阳性患儿年龄分布在2～26月龄，平均(11.0±5.2)月龄，各月龄组间差异无统计学意义(χ2= 18.712，P=0.284)。发病高峰为～12月龄组，与其他月龄组相比差异有统计学意义(χ2=6.722，P=0.01)(表3)；24月龄以下的患儿占总发病人数的95.8%(68/71)。

表3 2009年7月至2010年6月HRV、HuCV、AstV和AdV感染的月龄分布[n(%)]

Notes m: months; 1) Compared with other groups,P<0.05

图2 2009至2010年HRV腹泻患儿的季节分布

Fig 2 Seasonal distribution of HRV diarrhea from 2009 to 2010

图3 2009至2010年HuCV腹泻患儿的季节分布

Fig 3 Seasonal distribution of HuCV diarrhea from 2009 to 2010

2.4 AstV检测、分型及流行病学特点 AstV阳性12/300份(4.0%)，10例发生于2009年10月至2010年1月,2例分别发生于2010年3月和5月,季节分布差异无统计学意义(χ2=5.017，P=0.756)。12例AstV阳性患儿的月龄分布为2～16月龄，平均(8.4±4.9)月龄，各月龄组间的检出率差异无统计学意义(χ2= 0.513，P=0.47)(表3)。

2.5 AdV检测、分型及流行病学特点 AdV阳性8/300份(2.7%)，AdV阳性标本PCR产物经克隆测序，AD 2、3、5、7、12和41型各1例，AD 31型2例。2010年1～6月检出7/8例，2009年7～12月检出1/8例。发病月龄高峰集中于～12月龄组(4/8)(表3)。

2.6 4种病毒的混合感染情况 60.0%(180/300)至少检出4种病毒中的一种。混合感染23份，其中12份(52.2%)为HRV+HuCV，5份(21.7%)为HRV+AstV，2份为HuCV+AstV， HRV+AdV、HuCV+AdV、AdV+AstV、HRV+AstV+HuCV各1份。混合感染男女比例为1.1∶1，年龄2～20(8.3±4.7)月龄。47.8%(11/23)混合感染发生于2009年10～12月。

3 讨论

本课题得到了南京市医学科技发展资金和江苏省卫生厅医学科技发展基金的资助，但因我院仅检测HRV，其他病毒的粪便标本均送至北京中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肠道病毒室进行统一检测。

南京地区2009年7月至2010年年6月HRV血清型以G3型为主，其次为G2和G1型，G9型仅检测出1例，未发现G4和G8型。P基因型为P[8]和P[4]型，未发现其他分型。G血清型和P基因型组合以G3P[8]为主，其次为G3P[4]，与同一时期兰州地区的监测结果相同[22]，显示南京地区HRV G血清型和P基因型组合毒株呈现多样性,符合HRV抗原变异导致其流行血清型不断变化的特点。研究期间南京地区HRV腹泻高发季节为2009年10月至2010年1月，以秋冬季为主，与同一时期兰州地区的监测结果相同[19]；2岁以内婴幼儿HRV感染率达97.3%，提示HRV疫苗的适用对象应为<2岁的儿童。

本研究结果显示HuCV在南京婴幼儿腹泻中普遍存在，仅次于HRV，与广州地区[20](23.9%)和河北地区[21](22.7%)的检出率相仿，高于2008年南京地区[22]的检出率(9.7%)和与本研究同一时期兰州地区[19]的检出率(11.4%)，说明HuCV在南京地区的感染率呈上升趋势，且存在各地区感染的差异性。南京HuCV腹泻高发季节为2009年10～12月，与长春市[23]发病高峰为11月至次年1月基本一致，与兰州地区发病高峰为12月至次年3月有一定差异[19]。HuCV阳性24月龄以下患儿占95.8%，与长春市[23]报道相符(96.0%)。HuCV感染后潜伏期多为15～50 h，发病急，病程较短(12～60 h)，呈自限性，预后良好[24]。

随着分子生物学检测技术的提高，AstV感染逐渐受到关注。本研究中AstV在南京地区检出率为4.0%，与本地区2006至2007年的检出率(5.5%)无明显差异[25]。12例AstV感染患儿中83.3%发生于2009年10月至2010年1月，以寒冷季节为主，与HRV流行季节相似，全部病例均为18月龄以下婴幼儿。12份AstV阳性标本中有8份与其他病毒混合感染，说明AstV可能极易与其他病毒发生混合感染。

本研究2009至2010年南京地区AdV感染率仅为2.7%，与本地区2006至2007年的检出率(3.3%)无明显差异[25]，但低于同一时期兰州地区的检出率(10.7%)[19]。其中Ad 40和Ad 41型属于F亚组，称为肠道腺病毒(EAdv)，本次仅检出1例Ad 41型(1/4，25.0%)，与同一时期兰州地区的检测结果有显著差异(29/31，93.5%)[19]，说明EAdv在南京感染率较低。

本研究结果显示，HRV、HuCV、AstV及AdV是南京地区婴幼儿病毒性腹泻的重要病原，占病毒性腹泻的60%，其中HRV仍是首要病原，HuCV占第2位。不同病原的混合感染率为7.7%，以HRV与其他病毒混合感染为主。病毒性腹泻的高发年龄为2岁以下婴幼儿。本研究仍有40%的标本未检测出病毒病原，提示可能还存在其他病毒病原，今后的工作中还应加强新病原检测。

本研究的不足之处和局限性：①本次研究时间仅1年，因经费及人力问题收集标本较少，样本的代表性尚有限；②有120份阴性标本未能检测其他病毒，且未能对无症状的婴幼儿进行病毒检测，进一步了解4种肠道病毒在正常婴幼儿中的感染状况，有待在今后的研究中进一步完善。

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