谢海平，吴亚梅，张 亮，王华接

(1.中山大学生命科学学院，广东广州 510275;

2.广东省海洋与渔业环境监测中心，广东广州510222)

一株PHOTOBOICTERIUM LEIOGNATHI N1发光细菌的分离及鉴定

谢海平1，2，吴亚梅2，张 亮2，王华接2

(1.中山大学生命科学学院，广东广州 510275;

2.广东省海洋与渔业环境监测中心，广东广州510222)

对从海鱼(鲻鱼)表面分离到的1株发光强度很高的细菌N1进行系统分类鉴定。采用常规方法进行分离培养，以形态学特征、培养特性、生理生化特征以及分子生物学等方法对其进行分类鉴定。结果可知，该菌株为兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌，其16S rDNA核苷酸序列测定与Photoboicterium Leiognathi(鰒发光杆菌)的同源性达99.8%，系统进化树也显示，菌株N1与Photobacterium leiognathi构成一个分支;其形态特征与生理生化特性与Photoboicterium Leiognathi(鰒发光杆菌)完全吻合。确定此发光细菌为Photoboicterium Leiognathi(鰒发光杆菌)，命名为Photoboicterium Leiognathi N1。

Photoboicterium Leiognathi N1，发光细菌，分类鉴定，16S rDNA

发光细菌是一类在适宜条件下以及正常的生理条件下能够发射可见光的异养细菌，这种可见荧光波长在450～490nm 之间，在黑暗处肉眼可见［1］。目前，全世界已发现和命名的发光细菌有11种，分别属于弧菌属(Vibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)和异短杆菌属(Xenorhabdus)［2－3］。它们除了在水中自由浮游生存外，还能寄生于其他生物体的体表、消化道和发光器官上以及水中的沉降物中。通过文献［4］检索可知，许多生物的发光与发光细菌有关，但不同种类发光细菌的发光机理是相同的，是由特异性的荧光酶(LE)、还原性的黄素(FHNH2)、八碳以上长碳脂肪醛(RCHO)以及氧分子(O2)所参与的复杂反应。我们采集了多个冰鲜鱼(鲻鱼)样品，通过培养、分析、分离等方法得到一株发光强度很强的菌株N1，并对此进行了系统的分类研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品来源 从广州白云区萧岗农贸市场采集的多个冰鲜鱼(鲻鱼)样品;发光细菌培养基［5］胰蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、甘油0.3%、KH2PO40.1%、Na2HPO40.5%、NaCl 3%、琼脂2%，pH 6.5;营养琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、柠檬酸盐培养基、明胶蛋白胨培养基、1%赖氨酸脱羧酶、1%精氨酸双水解酶等生化实验反应管 广东光华化学厂有限公司;分析纯生化试剂、PCR反应引物、Taq DNA聚合酶、dNTP混合物等分子生物学试剂 深圳市华因赛生物技术有限公司。

表1 生理生化检验结果

1.2 实验方法

1.2.1 发光细菌的培养及分离纯化 首先擦拭冰海鱼表面，用生理盐水梯度稀释，进行倒置培养，再挑取单个发光菌落划线于营养琼脂平板上，进行纯化培养，按照革兰氏染色的步骤进行初染、媒染、脱色及复染，在显微镜下观察细菌的形态和染色特征。

1.2.2 发光细菌的鉴定 细菌的生理生化特征反应参照《伯杰氏细菌鉴定手册》［6］和《常见细菌系统鉴定手册》［7］进行。

1.2.3 细菌16S rDNA序列的测定及分析

1.2.3.1 菌株基因组DNA的提取 提取菌株基因组DNA［8］，作为 PCR 反应模板。

1.2.3.2 引物的设计 根据细菌16S rDNA序列保守性设计合成引物［9］:

1.2.3.3 PCR扩增16S rDNA序列 反应体系:10×PCR反应缓冲液5μL、dNTP混合物1μL，上浮引物F和下游引物R各1μL，模板DNA 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，加无菌水补足体积为50μL。反应步骤:94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，重复2～4 个步骤，30 个循环，72℃延伸7min。

1.2.3.4 16S rDNA序列的测序分析 将PCR反应扩增的16S rDNA片断送至上海英骏生物技术服务有限公司进行测序，利用BLASTn(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)程序从GenBank基因库中获得16S rDNA序列，进行DNA序列比对和同源性分析，并用Clustalx 1.83建立系统进化树。

2 结果与分析

2.1 形态、染色及培养特性

该菌株为革兰氏阴性杆状菌，在固体营养琼脂培养基中菌落表面光滑半透明，边缘整齐，菌落大小约2mm。在黑暗环境下，有明显的蓝绿色荧光，在营养肉汤培养基中呈扩散性浑浊，接种于厌氧培养箱中培养，能比较微弱地生长。

2.2 N1菌株的生理生化特性

根据文献对菌株N1的主要生理生化指标进行检测，查《伯杰氏细菌鉴定手册》［5］和《常见细菌系统鉴定手册》［7］可知，该菌株 N1 与PhotoboicteriumLeiognathi(鰒发光杆菌)的生理特性最为相似。

2.3 16S rDNA测序分析

测序获得菌株N1长度为1547bp的16S rDNA序列(图1)，通过BLAST程序在NCBI网站的比对结果显示:菌株N1的序列与Photoboicterium Leiognathi的16S核糖体序列相似性最高，达到99.8%(1463/1466)。

图1 N1的16S rDNA序列

2.4 应用Clustalx 1.83软件建立系统进化树

系统进化树图2显示，菌株N1与Photobacterium leiognathi构成一个分支，其亲缘关系最近。

3 讨论

本论文通过研究该细菌的形态学、培养特性、生理生化特征以及分子生物学特征，表明该菌株与发光杆菌属的Photoboicterium Leiognathi(鳆发光杆菌)最为相似，同源性达99.8%。鉴定该细菌为Photoboicterium Leiognathi(鰒发光杆菌)，命名为Photoboicterium LeiognathiN1。这同时也说明了冰海鱼(鲻鱼)的发光现象是由于其体表和体内聚集大量的鰒发光杆菌繁殖所致。

图2 根据菌株N1的16S rDNA序列构建的系统进化树

根据文献［10］检索而知，发光细菌对人而言，没有致病作用，因此，从市场上买回的海鱼夜晚发出蓝色的荧光，不必引起广大市民的恐慌。另外，发光细菌在环保上有很大功效，可以分解海洋中的有机污染物、净化海洋环境，在环境监测中，我们能结合现代的光电监测手段，作为测定环境中毒物的指标。

本实验筛选出的Photoboicterium Leiognathi N1为开发利用发光细菌提供了新的资源，菌株N1作为发光细菌在这方面的应用未有相关报道，还有待于进一步的研究。

［1］黄正.发光细菌的生理特性及其在环境监测中的应用［J］.环境科学，1995，16(3):87－90.

［2］许鸿章，毕可纺，姜旭光.烟台海域一株发光细菌的分离鉴定［J］.齐鲁渔业，1990(3):38－40.

［3］Johng Holt，Noel R，Krieg H，et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology(Ninth Edition)［M］.Williams＆Wilkins Baltimore，1994:371－377.

［4］杜宗军，王祥红，李海峰，等.一株海洋发光细菌的分离鉴定及其发光条件的初步研究［J］.海洋湖沼通报，2003(2):58－63.

［5］侯静涛，徐芙蓉，王广启，等.对一株海洋发光细菌保存方法的探究［J］.环境科学与管理，2008，33(10):167－169.

［6］布坎南R E，吉本期N E.伯杰氏细菌鉴定手册［M］.第八版.北京科学出版社，1984.

［7］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京科学出版社，2001.

［8］Syn C K C，Swarup S.A Scalable Protocol for the Isolation of Large－Sized Genomic DNA within an hour from several Bacterial［J］.Analytical Biochemistry，2000，278:886－901.

［9］都立辉，刘芳.16S rDNA基因在细菌菌种鉴定中的应用［J］.乳业科学与技术，2006(5):207－209.

［10］明儒成，商文东，侯继斌，等.一株ganghwense发光杆菌的分类鉴定及相关特性的研究［J］.微生物学杂志，2008，28(1):54－58.

Isolation and characterization of a luminous bacteria strain named Photoboicterium Leiognathi N1

XIE Hai－ping1，2，WU Ya－m ei2，ZHANG Liang2，WANG Hua－jie2

(1.School of Life Sciences，Sun Yat－sen University，Guangzhou 510275，China;
2.Guangdong Provincial Oceanic and Fishery Environment Monitoring Center，Guangzhou 510222，China)

A luminous bacteria strain N1 was isolated from a sea fish(mullet)，and it was classified systematically using routine methods，such as classified and characterized by its morpholog ical，cultural，physiological and biochemical features，and molecular biological.The results indicated that this strain belonged to facultative anaerobe fermentation and Gram－negative rod－shape bacteria.16S rDNA nuc leotide sequence testing showed it was most similar to Photoboic terium Leiognathi，and the homology was up to 99.8%.Phylogenetic tree also showed that N1 and Photobac terium leiognathi strains were from a batch.The cultural and physiological of this strain was totally identical to the Photoboicterium Leiognathi add itionally.So the strain was preliminary identified as Photoboicterium Leiognathi N1.

Photoboic terium Leiognathi N1;luminous bacteria;classification and identification;16S rDNA

TS201.2

A

1002－0306(2011)08－0230－03

2010－07－15

谢海平(1974－)，男，工程师，主要从事水产品药物残留检测及质量安全管理方面的研究。