龙志敏 赵蕾 高宝兵 汪克建 贺桂琼

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一 种进行性的不可逆的神经退行性疾病，现已成为严重威胁老年人健康的四大疾病之一，是临床最为常见的痴呆类型。神经细胞外β淀粉样蛋白(amyloid β peptide，Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques，SP)、细胞内tau蛋白过度磷酸化聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)、皮质和海马的神经元丢失是AD脑的三大典型病理特征。然而，关于AD的病理过程，目前尚无一个学说能全面解释，这导致AD的治疗仍缺乏特异性。近期一系列研究发现，糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3) 同时参与 AD病理特征SP和NFT的形成及神经元凋亡[1]。作为GSK-3β的选择性抑制剂，丙戊酸钠(valproic acid sodium salt，VPA)是否对AD患者脑组织起神经保护作用，本课题拟用VPA处理APP／PS双重转基因AD模型小鼠，结合免疫组化、甲硫素S染色、Nissl染色、TUNEL染色、ELISA定量检测来探讨VPA的神经保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 APP／PS1双重转基因传代小鼠的建立：将购于Jackson Lab雄性和雌性的APP／PS1双转基因杂合体种鼠B6C3-Tg(APPswe，PSEN1de9)85 Dbo／J合笼，交配繁殖。待产下的后代达3周龄时用PCR进行基因分型。

1.2 实验方法

1.2.1 基因分型 APP／PS1双重转基因小鼠的鉴定：剪子代小鼠鼠尾约0.5 cm，按照DNA提取试剂盒(Tiangen公司)步骤提取基因组DNA，核酸蛋白测定仪测定浓度后进行PCR扩增，1.5%Agrose gel电泳检测，紫外分析仪下观察同时出现APP，PS1条带的即为APP／PS1双转基因小鼠(见图1)。

PCR扩增：根据提供的引物扩增APP和PS1(以β-actin为内对照)。APP引物上游 5′-CACCA CAGAATCCAAGTCGG-3′，下游 5′-CTTGACGTTCT GGCCTCTTCC-3′；PS1 引物上游 5′-CAGGTGCTAT AAGGTCAT-3′，下游 5′-ATCACAGCCAAGATGAGC-3′；β-actin 引物上游 5′-GACAGGATGCAGAAGGA GAT-3′，下游 5′-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3′。反应条件：94℃ ×5 min→(94℃ 30 s→ 58℃ 40 s→ 72℃ 40 s) 共 35个循环→72℃ 10 min(-20℃保存PCR产物)。APP基因PCR产物长350 bp，PS1 扩增片段长 608 bp，β-actin 为 446 bp[2]。

1.2.2 动物分组及药物处理 待APP／PS1鉴定为阳性的小鼠取4月龄APP／PS1双重转基因小鼠24只，随机分为A、B两组(每组12只)。……