翟展艺 蒋军广 翟建霞 田 蕊 赵 娜

(郑州大学第一附属医院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

肺癌发病率及死亡率在近10年来呈明显上升的趋势，60%～80%的肺癌患者在诊断时已属晚期，治疗多采用以化疗为主的综合治疗。张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，多药耐药相关蛋白(MRP)是一种新的多药耐药相关蛋白基因。有关PTEN、MRP在肺癌发病机制中的作用尚存在争议。本实验检测不同组织类型、分化程度、临床分期及预后的肺癌组织标本中PTEN、MRP的表达，旨在探讨PTEN基因表达及细胞增殖凋亡在肺癌发生发展中的作用，以及MRP阳性表达与肺癌临床病理改变之间的关系。

1 对象和方法

1.1 标本 2002年9月至2006年11月在我院住院手术切除的肺癌患者 55例，男 42例，女 13例，年龄 36～81〔平均(58.93±21.96)〕岁。所有患者术前均未行放疗和化疗。标本均经病理证实，鳞癌31例，腺癌24例。根据1997年国际抗癌协会提出的TNM分期标准进行分期，ⅠA期0例，ⅠB期11例，ⅡA期1例，ⅡB期13例，ⅢA期15例，ⅢB期12例，Ⅳ期3例。对照组选择22例癌旁正常肺组织(距癌组织3 cm以上)。所有标本均为甲醛固定、石蜡包埋。连续4μm厚切片。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人PTEN多克隆抗体，鼠抗人MRP单克隆抗体，免疫组化法(S-P)通用试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化染色 采用S-P法，主要步骤如下:石蜡切片脱蜡水化，于柠檬酸缓冲液中行微波抗原修复，过氧化物酶阻断剂阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清阻断非特异性反应，滴加兔抗人PTEN多克隆抗体，鼠抗人MRP单克隆抗体，4℃过夜，加生物素标记的第二抗体，加链霉抗生物素-过氧化物酶溶液，DAB显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

1.2.3 结果判定 PTEN蛋白主要定位于细胞质，细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。从以下两方面进行定量判断:①阳性着色:无色为0分，淡黄色1分，棕黄色3分;②阳性细胞数:5个高倍视野在每张切片上计算1 000个以上癌细胞，阳性细胞数10% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～100%为3分。两类分数乘积，3分以下为阴性“－”，3分为弱阳性“+”，4分以上为强阳性“⧺”。MRP蛋白以胞质和胞膜呈棕黄色为阳性细胞。首先根据阳性细胞数目判断:高倍镜下随机选择肿瘤细胞密集区观察500个瘤细胞，计算其阳性细胞占肿瘤细胞的百分比。无阳性细胞为阴性，1分为阳性细胞数≤10%;2分为11% ～50%;3分为51% ～75%;4分为＞75%。再按染色强度计分:1分为浅黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色。以两者乘积为最后得分:≥3分为阳性，＜3分为阴性。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，行χ2检验。

2 结果

2.1 PTEN在正常肺组织及肺癌原发灶中的表达及其与临床病理特征的关系 23例正常肺组织中PTEN阳性表达率为86.95%(20/23)，55例肺癌组织中的阳性表达率为63.63%(35/55)，差异有统计学意义(χ2=4.242，P=0.03)。非小细胞肺癌(NSCLC)高、中分化PTEN阳性表达率为88.57%，低分化为20.00%，差异具有统计学意义(χ2=25.861，P ＜0.01)。TNM分期中Ⅰ、Ⅱ期PTEN阳性表达率92.00%，Ⅲ、Ⅳ期为40.00%，差异有统计学意义(χ2=15.934，P＜0.01)。有淋巴结转移者 PTEN阳性表达率50.00%，无淋巴结转移者为94.11%，差异有统计学意义(χ2=9.879，P＜0.01)。PTEN的表达与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤的临床类型、病理类型、肿瘤大小等均无关(均P＞0.05)。

2.2 MRP在正常肺组织及肺癌原发灶中的表达及其与临床病理特征的关系 23例正常肺组织中阳性表达率为34.78%(8/23)，55例肺癌组织中的阳性表达率为83.63%(46/55)，差异有统计学意义(χ2=18.171，P=0.000)。鳞癌中MRP阳性表达率93.00%，腺癌中为70.83%，差异有统计学意义(χ2=5.1，P＜0.05)。PTEN的表达与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤的临床类型、病理类型、分化程度、TNM分期、肿瘤大小等均无关(均P＞0.05)。

3 讨论

1997年发现的PTEN是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，该基因定位于第10号染色体q23.3，由9个外显子和8个内含子组成。PTEN基因具有双重磷酸酶的特异性，对蛋白质去磷酸化，特异地去除PIP3上的磷酸基团，然后分别通过抑制体内蛋白激酶B(PKB)和抑制黏附斑激酶(FAK)途径，对细胞增殖和凋亡进行负调节〔1，2〕。PTEN还可直接抑制细胞内PKB活性，阻断丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞信号转导途径，抑制细胞生长分化。PTEN可使FAK去磷酸化，从而抑制黏附斑复合物所介导的细胞浸润、生长分化。

本研究中肺癌组织PTEN的蛋白表达显著低于癌旁正常肺组织，肺癌PTEN表达降低，提示PTEN蛋白的低表达在肺癌的发生中可能起重要作用。PTEN蛋白阳性表达率与肺癌病理组织学类型无关，而与分化程度以及淋巴结转移有关。中高分化癌阳性表达率明显高于低分化癌，PTEN蛋白失表达在有淋巴结转移的NSCLC中明显高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义。提示PTEN表达下调与NSCLC的浸润转移密切相关〔3〕，这可能与其脂质磷酸酶活性有关，故PTEN通过使FAK去磷酸化抑制细胞的侵袭和转移〔1〕。PTEN有可能成为判断肺癌分化程度、转移及预后的指标。

MRP是由王宁〔4〕1992年在不表达 P-gp的人小细胞系H69AR中分离出的一种新的耐药基因蛋白，定位于16号染色体 p13.1，相对分子质量为 190×103，称 MRP。MRP与mdr/P-gp同属ATP结合盒式蛋白(ABC)超家族膜转运蛋白，也是ATP依赖的跨膜蛋白〔5〕。Wright采用免疫荧光检测肺癌组织中的MRP表达，发现其主要定位于细胞膜上;同时，在正常支气管上皮细胞及混合腺中也能见到其表达于基侧膜上，表明MRP主要存在于细胞膜上，但也有少量存在于细胞质中。MRP主要功能有两种:①位于细胞膜发挥药物外排泵的作用，主要通过协同机制转运结合还原型谷胱甘肽的药物。MRP作为一种ATP能量依赖的耦合输出泵(GS-X)，当抗肿瘤药物在谷胱甘肽转移酶的作用下与谷胱甘肽形成共轭物GS-X时，通过泵功能将GS-X迅速泵出细胞外，使细胞内药物浓度迅速下降，产生耐药。②位于细胞质内形成囊泡包裹药物，起隔离作用，避免药物损伤细胞核。本研究结果显示，MRP在肺癌中的检出率为83.63%，与文献相符〔6〕。MRP在腺癌中的阳性表达率较鳞癌中低，提示MRP可能与NSCLC的发生及病理类型有关。

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3 廖晓波，胡冬煦，周新民，等.利用组织微阵列结合免疫组化法研究PTEN，P16，P21，P53在肺癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.癌症，2004;23(3):334-8.

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