魏鹏飞, 冯杰, 王栋, 郑志永, 詹晓北＊, 张丽敏

(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122)

响应面法优化酱油生产用大曲培养基

魏鹏飞1,2, 冯杰1,2, 王栋1,2, 郑志永1,2, 詹晓北＊1,2, 张丽敏1,2

(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122)

在工厂大曲培养基的基础上,采用响应面法对影响大曲蛋白酶活的关键影响因子进行了研究和探讨。用统计学方法建立了大曲蛋白酶活和培养基组成的二次多项式数学模型,并求解得到了大曲培养基组成的最佳配比,即豆粕∶炒麦∶拌料水的比例为11.3∶10.5∶19.6(g∶g∶m L)。在此最佳配比下大曲蛋白酶活达到2 402U/g,比对照配方的酶活提高了20%。

酱油生产;大曲;蛋白酶;响应面法;优化

制曲是中国传统技术,谚语有一曲、二醪、三熬油的说法,说明了制曲的重要性。目前酱油酿造主要选用纯种米曲霉,以适宜的条件保证米曲霉等有益微生物生长繁殖,使米曲霉分泌产生所需要的各种酶系,达到大曲优质高产的目的[1]。

蛋白酶作为米曲霉分泌的酶系中能够提高原料蛋白利用率,提高发酵酱油氨基态氮含量的关键酶,其在大曲制作过程中的产量对酱油品质的好坏和生产成本的高低有着直接的影响,而且提高蛋白酶活还可以减少酿造工业的污染[2-3]。在实际的酱油生产过程中,多方面因素影响着制曲过程中成曲蛋白酶活的高低。国外有文献提到培养基的成分和水活度是两个比较重要的影响固态发酵中真菌产酶的因素[4]。工厂中主要采用蒸熟后豆粕与炒麦混料模式制作大曲培养基[5],可以看出大曲培养基对产酶有着比较重要的影响。因此,有必要对大曲培养基的组成进行优化。

目前,统计优化方法有很多,响应面分析法是一种非常适用的实验设计方法,具有实验设计、建模、因子效应评估、寻求因子水平最佳操作条件以及数据统计处理等功能,显示出了其他实验方法如正交实验、因子实验等所不具备的优点[6-9]。响应面分析法中的中心组合设计有着实验次数少,精度高,预测性好等优点,近年来经常被用于发酵培养基优化、最佳反应条件寻优等方面[10-13]。

针对酱油生产的高盐稀态工艺,选择豆粕、炒麦和拌料水为考察变量,在工厂生产大曲经验配方的基础上,应用中心组合设计,以大曲的蛋白酶活作为响应值,并采用多元二次回归和方差分析等手段,对大曲培养基的组成进行优化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 米曲霉(Aspergillus oryzaeCICIM F0899),由作者所在的江南大学生化工程与反应器研究室保藏。

1.1.2 培养基

1)菌种活化培养基:马铃薯蔗糖琼脂培养基[2]。

2)小曲培养基[2]:按照麸皮∶豆粕质量比为4∶1的比例在250mL三角瓶中加入20 g过10目筛的干料,12 g蒸馏水,拌匀。121℃,0.1M Pa灭菌30 m in。

1.1.3 原料 食用大豆粕:河北秦皇岛益海豆粕有限公司生产,符合中华人民共和国食用大豆粕卫生标准(GB 14932.1-2003)[14];冬小麦:无锡三里桥粮油市场购买。

1.2 方法

1.2.1 制曲方法 将豆粕、炒麦和拌料水按照设计配比混匀后,经过121℃,30 min灭菌处理。按照质量分数1%接种量接入培养好的种曲,控制曲料品温在30℃培养48 h,取样测定大曲蛋白酶酶活。

1.2.2 小麦焙炒粉碎 小麦在320℃条件下焙炒1～3 min,其中焦糊粒不超过5～20%,小麦裂嘴为90%以上,熟麦投水实验时,沉降率为3～5%[15]。

1.2.3 取样时间确定 以中心点初始配方,即工厂大曲培养基制曲,分段取样测定大曲的蛋白酶活,从而得到大曲蛋白酶活随时间的变化曲线,以确定测定大曲酶活的最佳时间。

1.2.4 蛋白酶提取方法 向取出的大曲曲样中加入1∶20(g∶m L)的 0.1mol/L,p H值为 7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液,于40 ℃水浴中,间歇搅拌,浸提1h,滤纸过滤得蛋白酶酶液。

1.2.5 蛋白酶活测定方法 采用福林酚法。参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)[16]。大曲蛋白酶活定义为1g干重大曲中所含的蛋白酶在40℃,p H值为7.2条件下每1 min水解干酪素产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位(U)。

1.2.6 分析优化方法 大曲培养基组成按照响应面分析法中的中心组合设计进行优化。中心组合设计由Box和Wilson提出,是响应曲面中最常用的二阶设计,它由3部分组成:立方体点、中心点和星点[17]。对于本实验,选择大曲配方中的豆粕、炒麦和拌料水3个因素,并以工厂的经验配方为初始水平,考察制曲过程中蛋白酶活的变化,对大曲培养基的组成进行优化,中心点实验选择6次。此设计由全23因子设计构成的8个点,6个中心点的重复以及6个星臂点,即每个因素轴上距中心点±α处各一个点组成。轴距离α选择为1.682使得该设计为正交设计[10]。为了预测最佳点,用二次多项式拟合中心组合设计的实验数据。该多项式方程为:

式中,Y为预测响应值,即大曲的蛋白酶活;X1、X2和X3分别为豆粕、炒麦和拌料水。

实验进行设计和数据利用Design-Expert7.1.3(Stat-Ease,Inc.)软件对处理,用F(Fischer)检验评价数学模型方程的显著性,方程的拟合性由确定系数R2确定,以确立大曲培养基中豆粕、炒麦和拌料水的最佳配比。

2 结果与讨论

2.1 大曲的生长产酶曲线

以中心点初始配方,即工厂大曲培养基制曲,分别在 0、12、24、36、48和 72 h取样测定大曲的蛋白酶活,从而得到了大曲蛋白酶活随时间的变化曲线。实验结果见图1。

由图1可知,大曲的蛋白酶的产生主要集中在12～36 h,蛋白酶活在48 h时达到最大,并随着制曲时间的增长蛋白酶活会逐渐下降。因此选择48 h作为取样测定大曲蛋白酶活的最佳时间点。

图1 酱油大曲的产蛋白酶过程曲线Fig.1 Protease production of Aspergillus oryzae in koji

2.2 中心组合实验优化大曲培养基组成

对影响大曲生产中蛋白酶酶活的培养基组成中的豆粕、炒麦和拌料水进行了三因素五水平响应面分析试验。试验设计与结果见表1和表2。

表1 响应面分析试验因素水平表Tab.1 Factors and levels for response surface analysis

表2 响应面中心组合设计及试验结果Tab.2 Response surface central composite design and corresponding experiment results

由此实验的实际值用二次多项式进行回归,其结果见表3。

表3 试验结果的回归分析Tab.3 Regression analysis of the experiment results

由表3中的回归系数可以写出二次多项式回归方程为:

对该回归方程进行方差分析,方差分析结果见表4。

表4 二次多项式回归模型的方差分析Tab.4 Analysis of variance for quadratic polynomial model

由表4的方差分析看出,该模型的举动决定系数R2=0.927 9,显著性水平α=0.000 1。R2值0.972 9说明了97.29%的响应值变化是由该模型决定的。R值为0.963 3说明实验中蛋白酶活的实际值与模型预测值有96.33%的一致性。由此表明,该模型可对实验结果进行较准确的预测。

此外,由表4中的方差分析可以看出,因素X1、X2即豆粕和炒麦的交互影响显著性水平α=0.886 6,远远大于0.05(置信水平95%),说明豆粕和炒麦的交互影响对大曲蛋白酶活的影响不够显著。由方差分析还可以看出拌料水在大曲培养基中所占的比例对大曲最终蛋白酶活的影响非常显著。大曲培养基组成中的豆粕、炒麦和拌料水与大曲蛋白酶活的关系分别见图2、图3和图4。响应面可以直接反映出各因子对响应值的影响大小。分析图2、图3和图4可以看出分析结果和方差分析的结果相一致。

2.3 模型验证

对拟合出的二次多项式回归方程分别求X1、X2和X3的偏导数,求得各个因素的极值点:

即大曲培养基组成的配比为豆粕∶炒麦∶拌料水=11.3∶10.5∶19.6时产蛋白酶活最高。以上述分析得到的最佳培养基组组成制曲,做三次平行实验取蛋白酶活的平均值验证试验结果,结果见表5。

图2 豆粕和炒麦配料比对蛋白酶活影响的响应面图Fig.2 Contour plot of protease activity at various weights of soy bean and fried wheat

图3 豆粕和拌料水配料比对蛋白酶活影响的响应面图Fig.3 Contour plot of protease activity at various weights of soy bean and water

图4 炒麦和拌料水配料比对蛋白酶活影响的响应面图Fig.4 Contour plot of protease activity at various weights of fried and water

表5 最优条件下蛋白酶活的预测值与试验值比较Tab.5 Performance comparison of protease activity between the model simulation and experiment results at optimum conditions

可知,蛋白酶活的预测值为2 455 U/g,实验实际值为2 402 U/g,实际值与预测值的相对误差为2%,在模型允许的误差范围之内。说明模型能很好地预测实际制曲情况,响应面分析方法可靠。

3 结 语

本实验选择大曲配方中的豆粕、炒麦和拌料水3个因素,在工厂经验配方的初始水平上,应用响应面法对大曲培养基组成进行优化。借助Design Expert软件,用统计学方法建立了大曲蛋白酶活和大曲培养基组成的二次多项式数学模型,并通过分析模型方程和响应面3D图得到了大曲培养基组成的最佳配比,即豆粕:炒麦:拌料水的比例为11.3∶10.5∶19.6。通过对大曲培养基的优化,酶活比未经优化的经验配方提高了20%。通过对模型的方差分析和响应面3D图分析,可以看出在大曲生产过程中,豆粕和炒麦的比例对大曲产蛋白酶活的影响较小,而拌料水在大曲中所占的比例对蛋白酶活有着很重要的影响,这对酱油酿造工厂大曲生产有着一定的指导意义。

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Optimization of Koji Medium in Soy Sauce Production Using Response Surface Methodology

WEI Peng-fei1,2, FENG Jie1,2, WANGDong1,2, ZHENG Zhi-yong1,2,ZHAN Xiao-bei＊1,2, ZHANG Li-min1,2
(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Based on the factory production medium formula of koji,response surface methodology was used to optimize the protease production in this manuscript.A multivariate model was proposed to manifest the interactions of the medium components.It was showed that the optimum,weight proportion of soy bean,fried wheat and water in koji medium is 11.3∶10.5∶19.6 with this optimum conditions,a high level of koji protease activity(2402 U/g)was achieved,it was higher 20%than that of the control.

soy sauce production,koji,protease,response surface methodology,optimization

Q 819

A

1673-1689(2011)03-0422-05

2010-05-21

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD23B00);国家“十一五”科技支撑计划项目(2008BA I63B06,2007BAK36B03)。

＊

詹晓北(1962-),男,北京人,教授,博士研究生导师,主要从事生化工程与反应器等研究。Emial:xbzhan@yahoo.com

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