丁振柱, 黄仁华, 王 丹

(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010)

费约果叶片总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

丁振柱, 黄仁华＊, 王 丹

(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010)

对费约果叶片总黄酮的提取工艺和抗氧化活性进行了研究。结果表明:费约果叶片总黄酮最佳提取工艺为温度50℃、料液比1∶30(g∶mL)、提取时间50 min和甲醇体积分数70%。根据最佳提取工艺,重复3次得到总黄酮量分别46.89、44.51、48.27 mg/g,具有稳定性和可操作性;另外,通过半抑制浓度IC50衡量费约果叶片总黄酮提取物抗氧化活性,其抗脂质过氧化能力(IC500.275 mg/m L)和DPPH·自由基的清除能力(IC500.798 m g/m L)均优于抗坏血酸(IC500.643、IC500.917 mg/m L),而超氧阴离子自由基的清除能力(IC500.774 mg/m L)和羟自由基的清除能力(IC500.278 m g/m L)均弱于抗坏血酸(IC500.537、IC500.275 mg/m L)。

费约果;总黄酮;提取;抗氧化

费约果(Feijoa sellowianaBerg)系桃金娘科多年生亚热带常绿灌木果树,原产于南美洲的巴西和乌拉圭,2004年由西南科技大学从新西兰引种至我国四川绵阳地区[1],经过近几年驯化引种研究,已逐步进入推广种植阶段。费约果叶片中含有大量的生物活性物质,包括维生素、黄酮、豆甾醇、β-胡萝卜素、对羟基苯乙醇等等,是一种理想的绿色药用资源[2]。本研究以费约果叶片为原料,采用正交试验设计优化总黄酮提取工艺并分析提取物浓度与抗脂质过氧化、DPPH·、O2-·、·OH等自由基清除率的关系,为进一步推广费约果的种植和发掘天然抗氧化活性成分以及提高费约果的经济利用价值提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用费约果叶片于2009年3月中旬采自西南科技大学西山校区费约果栽培园中。三吡啶三吖嗪(Tripyridyl triazine,TPTZ)、1,1-二苯基苦基苯阱(DPPH)及芦丁购自 Sigma公司,其他药品均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计 UV-1900:日本岛津产品;台式高速冷冻离心机:美国Beckman产品;KQ5200B型超声波清洗机:旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂生产;恒温水浴锅:上海亚荣生化仪器厂生产;循环水式多用真空泵 SHB-ⅢS:郑州长城科工贸有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 费约果叶片总黄酮提取工艺优化的正交试验 影响植物组织类黄酮提取的因素很多,根据前人研究结果结合单因素实验(实验结果未列出),结果发现最主要的因素包括提取温度、料液比、提取时间和甲醇体积分数,而且各因素之间存在着交互作用,据以此本实验采用L9(34)进行正交试验,以费约果叶片提取物中总黄酮的含量确定最佳提取工艺,试验设计的影响因素及水平条件见表1所示。

1.3.2 费约果叶片总黄酮提取 根据 Kim的方法结合超声波提取叶片中的总黄酮[3]。准确称取新鲜费约果叶片1.0 g用于总黄酮的提取,将新鲜的样品表面水分晾干后放在冰浴上研磨,直至研磨到没有肉眼可见的块状叶片后将匀浆转入离心管中,按照正交试验设计进行超声波提取,提取后4℃条件下4 000 r/m in离心10 m in收取上清液,转移至50 m L蒸发瓶中,在40℃条件下旋转蒸发提取液中的甲醇,直至蒸干。用4 m L重蒸去离子水溶解残留物并转移至10 mL离心管中,4℃条件下10 000 r/min离心10 m in,上清液贮存于-20℃冰箱中备用。

表1 费约果叶片总黄酮提取正交试验因素设计Tab.1 Orthogonal experiment design for extracting flavonoids from Feijoa leaves

1.3.3 费约果叶片总黄酮含量测定 根据 Kim等方法测定总黄酮含量[3-4],取提取液0.1 mL放入10 m L试管中,接着加入1.9 m L重蒸去离子水混合均匀后,立即往试管中加入0.15 m L质量分数为5%NaNO2充分震荡,5 min后加入0.15 mL质量分数为10%A lCl3反应1 m in后,加入1 m L 1 mol/L NaOH混合均匀,室温放置反应3～5 min,当反应液颜色变至粉红色,在510 nm条件下用分光光度计测定OD值。用芦丁(Rutin)作标准曲线,叶片总黄酮含量用等量芦丁表示。

1.3.4 抗脂质过氧化能力的测定 分别于样品管中依次加入1 m L卵磷脂溶液(将300 mg卵磷脂溶于30 m L 10mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液的溶液中,冰浴振荡)、1 m L 0.4 mmol/L硫酸亚铁、1 m L样品,混匀。避光于37℃水浴60 min,加入2 m L三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-HCl混合液(15 g TCA,0.37 g TBA,2.1 m L浓盐酸依次放入100 m L水中),90～100℃水浴15 m in,迅速冷却,以3 000 r/min离心10 min,取上清液在535nm测吸光度A1。空白管以1 m L重蒸水代替1 m L样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度A2,参比管中以1 m L重蒸水代替1 m L卵磷脂。根据其线性回归方程求出吸光度为0.5时所需样品的有效浓度(IC50),抗坏血酸为阳性对照[5]。

抑制率(%)=[(A2-A1)/A2]×100

1.3.5 对DPPH·自由基清除率的测定 准确移取不同浓度费约果叶片总黄酮提取液2 m L于10 m L试管中,加入 2 m L DPPH·溶液 (8 mg DPPH·用体积分数80%无水乙醇溶解并定容于100 m L棕色容量瓶),充分混匀,室温静置,30 m in后用分光光度计在517 nm下测定其吸光度A1(以体积分数80%无水乙醇溶液为参比);同时测定2 mL DPPH·溶液与2 mL体积分数80%无水乙醇溶液混合液的吸光度A2,以及不同浓度2 m L提取液与2m L 80%无水乙醇溶液混合液的吸光度A3。平行测定3次,取平均值后根据以下公式计算清除率。根据其线性回归方程求出吸光度为0.5时所需样品的有效浓度(IC50),抗坏血酸为阳性对照[6]。

清除率%=[1-(A1-A3)/A2]×100%

1.3.6 对超氧阴离子自由基清除率的测定 先将50 mmol/L Tris-HC1缓冲液(PH 8.2),3 mmol/L邻苯三酚溶液(用10 mmol/LHC1配制),置25℃水浴预热15 min。然后取 Tris-HC1缓冲液4.0 m L于试管中,加入不同浓度供试液 1.7 m L,3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL,以加入邻苯三酚的瞬间开始计时,以水为空白,测定反应开始第100秒时,325 nm波长处吸光度A1。对照组A2使用无水乙醇代替供试液,对照组(A3)使用10 mmol/L HC1溶液代替邻苯三酚溶液。每个浓度梯度平行测定3次,求平均值。并根据其线性回归方程求出吸光度为0.5时所需样品的有效浓度(IC50)。同时,以抗坏血酸作为阳性对照[7]。

清除率%=[A2-(A1-A3)]/A2×100%

1.3.7 对羟自由基清除率的测定取1 m L 9 mmol/L硫酸亚铁与1 mL 10 mmol/L水杨酸于10 m L试管充分混合后,分别加入不同浓度费约果叶片总黄酮提取液1 mL,加1 m L过氧化氢(8.8 mmol/L)启动反应,37℃反应30 min,以蒸馏水作参比,在510 nm下测吸光度A1。对照组A2用无水乙醇代替供试液。对照组A3用纯净水代替过氧化氢(8.8 mmol/L)。每个浓度梯度平行测定3次,求平均值。并根据其线性回归方程求出吸光度为0.5时所需样品的有效浓度(IC50),以抗坏血酸作为阳性对照[8]。

清除率%=[A2-(A1-A3)]/A2×100%

2 结果与分析

2.1 费约果叶片总黄酮提取正交试验

以提取温度、料液比、提取时间、甲醇浓度为因素的L9(34)正交试验结果见表2所示,每个处理提取3次。从表中极差分析可以看出,提取温度显著影响着费约果叶片总黄酮的提取效果,表现最为明显,其次为料液比,影响最小的因素为甲醇浓度,即各因素对费约果叶片总黄酮提取效果的主次顺序为提取温度>料液比>提取时间>甲醇体积分数,进一步分析可以发现提取工艺的最优方案为A1B1C2D2,即提取温度50 ℃、料液比1∶30(g∶mL)、提取时间50 min和甲醇体积分数70%为最佳提取工艺组合。根据最佳提取工艺组合进行3次重复试验,得到的费约果叶片总黄酮提取物量分别为:46.89mg/g、44.51mg/g、48.27 mg/g,均要高于正交表中所有试验结果,且具有较好的重现性和可操作性。

表2 费约果叶片总黄酮提取正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal experiment for extracting total flavonoids from Feijoa leaves

2.2 费约果叶片总黄酮提取物抗氧化活性

费约果叶片总黄酮提取物对 Fe2+引发的卵磷脂脂质体过氧化的抑制作用见图3(a)所示,当总黄酮提取物质量浓度为0.2 mg/mL时,抑制率为43%,质量浓度为0.4 mg/m L时抑制率为69%,再增加提取物质量浓度,抑制率增长缓慢。用半抑制浓度IC50衡量,费约果叶片总黄酮提取物抗脂质过氧化能力(IC500.275 mg/m L)要显著优于抗坏血酸(IC500.643 mg/mL)。

图3(b)反映了费约果叶片总黄酮提取物清除DPPH·能力与浓度的变化关系,从图中可以看出,随着提取产物总黄酮质量浓度的增加,DPPH·的清除率也随之增加,且在低浓度范围内(0.5～1.0 mg/mL)增长较快。另外,质量浓度为0.5 mg/m L时,费约果叶片总黄酮提取物对DPPH·的清除率与抗坏血酸相当,而较高质量浓度下费约果叶片总黄酮提取物对DPPH·的清除率高于抗坏血酸。用半抑制浓度IC50衡量,费约果叶片总黄酮提取物对DPPH·的清除能力(IC500.798 mg/m L)要优于抗坏血酸(IC500.917 mg/m L)。

图1 费约果叶片总黄酮不同浓度提取物抗脂质能力(a)、清除DPPH·能力(b)、清除O2-·(c)和清除·OH(d)能力Fig.1 Capability of total flavonoids with various concentrations from Feijao leaves on inhibiting lipid peroxidation,scavenging DPPH.,O2-·and ·OH

从图3(c)和图3(d)中可以看出,费约果叶片总黄酮提取物对超氧阴离子(O2-·和羟自由基(·OH)的清除率均随着浓度的增加而增强。但在相同浓度条件下,费约果叶片总黄酮提取物对超氧自由基和羟自由基清除率均显著低于抗坏血酸。用半抑制浓度IC50衡量,费约果叶片总黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除能力(IC500.774 mg/m L)和对羟自由基的清除率(IC500.278 mg/m L)均要弱于抗坏血酸(IC500.537 mg/m L)和(IC500.064 m g/m L)。

3 结 语

通过对费约果叶片总黄酮提取工艺的单因素试验(预实验结果未列出)和正交试验分析,确定了费约果叶片总黄酮提取的最佳工艺为提取温度50℃、料液比1∶30(g∶m L)、提取时间50 m in和甲醇体积分数70%。

抗氧化活性实验结果显示,费约果叶片总黄酮提取物对脂质过氧化具有较强的抑制效果,且显著高于抗坏血酸,其原因可能是费约果叶片中黄酮提取成分中具有能螯合铁离子的有效物质,表现出了较强的抗脂质过氧化[9];另一方面,费约果叶片总黄酮提取物在清除O2-·、·OH等离子方面要弱于抗坏血酸,可能与黄酮有效成分的结构有关,有待进一步研究。

（References）：

[1]王丹,刘仁道,任少雄.实用、观赏兼用果树新种类费约果引种的气候适应性分析[J].中国南方果树,2007,6:39-41.

WANGDan,L IU Ren-dao,REN Shao-xiong.Analysis on the climate adaptability of feijoa fruit[J].South China Fruits,2007,6:39-41.(in Chinese)

[2]Paola B,LuigiM,Marco M,et al.Feijoa sellowiana derived natural flavone exertsanti-cancer action displaying HDAC inhibitory activities[J].Int J Biochem Cell B,2007,39:1902-1914.

[3]Kim D O,Jeong SW,Lee C Y.Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivarsof plums[J].Food Chem,2003,81:321-32.

[4]李云志,曾凡骏,李帆元.宝枫叶总黄酮的提取研究[J].食品与生物技术学报,2006,25(1):27-30(49).

LI Yun-zhi,ZENG Fan-jun,L IFan.The extraction of flavonoids from the leaves of acer truncatum bunge[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2006,25(1):27-30(49).(in Chinese)

[5]李颖畅,孟宪军.蓝莓叶黄酮提取物抗氧化活性的研究[J].营养学报,2008,30(4):427-429.

L IYing-chang,M ENG Xian-jun.Studies on antioxidant activity of flavonoids from leaves of blueberry[J].Acta Nutriment a Sinica,2008,30(4):427-429.(in Chinese)

[6]Sreenivasan S,Ibrahim D,Kassim M JN M.Free radical Scavenging Activity and Total Phenolic Compounds ofGracilaria Changii[J].Int J Natur Eng Sci,2007,1(3):115-117.

[7]余芳丽,余萍,户勋,方一泓.凤眼莲总黄酮最佳提取条件的探讨[J].生物技术,2008,18(2):52-54.

YU Fang-li,YU Ping,HU Xun,FANG Yi-hong.Study on the optimum conditions of extracting total flavonoids from water hyacinth[J].Biotechnology,2008,18(2):52-54.(in Chinese)

[8]马利华,贺菊萍,秦卫东,刘鸿源.槐花提取物抗氧化性能研究[J].食品科学,2007,28(9):75-77.

MA Li-hua,HE Ju-ping,Q IN Wei-dong,WANG Ping.Study on antioxidant activities of pogadatree flower(Robinia Pseudocacia L.)Extracts[J].Food Science,2007,28(9):75-77.(in Chinese)

[9]Ock-Sook Yi.Antioxidant activity of grape extracts in a 1ecithin 1iposome system[J].J Am Oil Chem Soc,1997,74:1301-1306.

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activities of the Total Flavonoids from Feijoa sellowiana Leaves

DING Zhen-zhu, HUANG Ren-hua＊, WANG Dan

(College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621002,China)

This manuscript optimized the extraction technologies and investigated the antioxidant activities of the total flavonoids fromFeijoa sellowianaleaves.The results determined that the optimum parameters of extraction process as follow s:the extraction temperature 40℃,the ratio of sample to extraction solution 1:30,the extraction time 50 min and the concentration methyl alcohol 70%.With the optimum extraction parameters,the total flavonoids contents with three reiterations achieved at 46.89 mg/gFW,44.51 mg/gFW and 48.27mg/gFW,respectively.In addition,half-inhibitory concentration IC50 was used to evaluate antioxidant activities of total flavonoids from Feijoa leaves.The capability of inhibiting lipid peroxidation(IC500.275 mg/mL)and scavenging effects on DPPH freedom radical(IC500.798 mg/m L)of to talflavonoids extracts were stronger than the co rresponding values of ascorbic acid(IC500.643 mg/m L and IC500.917 mg/m L).However,the scavenging effects on superoxide anion(IC500.774 mg/m L)and hydroxyl freedom radical(IC500.278 mg/mL)were weaker than that of ascorbic acid(IC500.537 mg/m L and IC500.275 mg/m L).

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Feijoa sellowiana,total flavonoids,extraction technology,antioxidant activities

TS 201.2

A

1673-1689(2011)03-0371-05

2010-05-20

四川省科技厅重点项目(07zs2106);西南科技大学博士基金项目(08zx7104)。

＊

黄仁华(1979-),男,湖北钟祥人,农学博士,副教授,主要从事植物化学成分结构与功能开发方面的研究。Email:huangrenhua@sw ust.edu.cn

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