贾慧敏，王晓东，陈青江，张涛，王维林

（1.中国医科大学 附属盛京医院小儿外科，卫生部小儿先天畸形重点实验室，沈阳 110004；2.沈阳市第四人民医院普外科，沈阳110031）

肛门直肠畸形（anorectal malformations，ARM）术后排便功能障碍与神经肌肉的异常发育导致肠道动力改变密切相关，然而ARM神经肌肉发育异常的机制至今仍不清楚，与ARM的胚胎发生机制是否相通也不明了［1］。目前认为Notch信号通路在调控细胞生长分化、组织更新及调节细胞内环境稳定中发挥重要作用［2，3］。Notch信号通路尤其在胃肠道的胚胎发育过程中起着重要作用［4］。Notch-1及其配体Jagged-2是表达于肠道基质的两种重要的Notch通路中的成员，但迄今为止其复杂的调控机制仍不清楚，是否参与ARM发生后末端直肠的发育也无报道。本研究通过对Notch-1及Jagged-2基因在E16~E21的正常及ARM大鼠胚胎直肠的表达情况来探讨它们可能在ARM大鼠胚胎的直肠发育中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用体质量为220～250 g健康成熟未育的Wistar大鼠75只，雌鼠60只，雄鼠15只（购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与取材：按雌雄比例4∶1晚上合笼过夜，次日晨雌鼠做阴道涂片。在光镜下见到精子即提示交配，当日为孕0 d（E0），并随机分为2组。ETU组：40只孕鼠于E10时按125 mg/kg给予1%乙烯硫脲（ethylenethiourea，ETU）经胃管注入大鼠胃内；对照组：20只灌入等量蒸馏水，继续保持妊娠。ETU组和对照组大鼠分别做以下处理：于E16~E21根据计划选取一定数量各胎龄的孕鼠，在10%水合氯醛（4 m1/kg）腹腔注射麻醉下，应用解剖显微镜（放大倍数7.5～64倍）行剖宫术，取出所有胎鼠，其中E16胚胎取整个胚胎，E17~E21胚胎取其盆部，所有标本经0.01 mol/LPBS液冲洗。部分E17、E19、E21的对照组和ETU组的胎鼠，在显微镜下辨别畸形后进一步分为正常组和ARM组，无菌条件下取直肠末端/盲端部分置于EP管中于-80℃深冻保存，备Western blot及RT-PCR用。其余标本置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定12~36 h，常规脱水，石蜡包埋，制成蜡块。

1.2.2 免疫组化方法：对照组及ETU组的胎鼠正中矢状面及横断面连续切片，根据镜下观察进一步分为正常组和ARM组，进行Notch-1及Jagged-2一抗（1∶150）免疫组化染色。连续动态对比观察Notch-1及Jagged-2在正常和畸形大鼠胚胎结直肠发育过程中的表达。免疫组化染色具体步骤：加入一抗，4℃孵育12 h。二抗采用S-P试剂盒，DAB显色经苏木素复染，脱水、透明后封片。Notch-1及Jagged-2免疫组织化学染色见胞浆呈棕黄色为阳性，该细胞为阳性细胞。每次染色均设阴性和阳性对照。采用NISElements Basic Research多媒体彩色病理图像分析系统对Notch-1及Jagged-2的表达进行图像分析。

1.2.3 Western blot方法：（1）显微镜下取新鲜末端直肠组织应用南京凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白。其含量按改良Lowry法测定，于-20℃冻存备测。（2）Western杂交：取总蛋白 40μl，经6%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转移至硝酸纤维膜（Invitrogen公司）上，5%牛血清白蛋白封闭抗原后，加入Notch-1及Jagged-2抗体（1∶200）和 β-actin抗体（1∶5 000），4℃孵育 12 h。次日洗膜后加碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG（1∶2 000）进行二抗杂交、显色。结果采用GIS-2020凝胶图象分析系统扫描分析结果，对蛋白质含量进行密度分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。

1.2.4 RT-PCR检测组织中Notch-1、Jagged-2 mRNA的表达：（1）总 RNA 提取；（2）逆转录合成 cDNA，逆转录试剂盒购于Takara公司，采用试剂盒推荐方法。（3）Notch-1、Jagged-2基因的 PCR扩增：引物设计参考美国国立医学图书馆Medline基因库，利用Primer 5.0版软件设计引物，由上海Invitrogen生物技术有限公司合成，各基因引物序列及扩增条件见表1。（4）琼脂糖凝胶电泳。用G：BOX SYNGENE凝胶分析系统拍照，以Kodar Digital Science 1.0 DNA分析软件系统对PCR产物进行半定量分析。以βactin内参照相对密度mass（ng）值标化Notch-1、Jagged-2 mRNA的mass值，得到相对含量进行分析。

1.3 统计学分析

所有数据均以x±s表示，差异比较采用SPSS 13.0统计软件进行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体实验结果

对照组共产胎仔192只，未见畸形。ETU组中221只出现ARM，畸形率为61.1%；均为直肠尿道瘘和泄殖腔畸形。根据切片观察及显微镜下观察后分为正常组（n=120）和ARM组（n=150）进行本实验。

2.2 Notch-1及Jagged-2大鼠胚胎期直肠壁内的表达情况

表1 Notch-1、Jagged-2及β-actin引物序列及扩增片段长度Tab.1 Primer sequences and product size of Notch-1，Jagged-2 andβ-actin amplification

2.2.1 免疫组化染色结果：正常组：E16时，肠壁各层发育尚不清晰，并未观察到明显的阳性细胞；E17时，直肠壁环肌层逐渐发育，并可见阳性细胞群位于肌肉细胞内，黏膜层也有表达；E19-20，肠壁肌层发育逐渐完善，纵肌层开始分化，并可见大量阳性细胞位于肠道平滑肌及肠间神经丛部位（myenteric nerve plexus，MP）和黏膜层。ARM组：E16时，可以观察到所有标本短尾或无尾，直肠尿道间存在瘘管；直至E17时，直肠盲端及瘘管周围均并未见到阳性细胞表达；E19后，上位结肠可见大量阳性细胞位于肠壁内；随着接近盲端，肠壁各层分化不良，盲端已经见不到正常肠壁结构，阳性细胞分布逐渐减少，横断面上更显示出瘘管周围肌肉形态异常，也不能看到神经丛结构；E20~21，这种变化更加明显（图1、2）。

Jagged-2在大鼠胚胎期直肠壁内的表达情况：免疫组化结果提示Jagged-2的表达时空分布与Notch-1相同（图略）。

2.2.2 Western blot结果：在17 d以后，Notch-1在正常组和ARM组都有表达，E17~21时正常组的表达较致畸组明显增强，具有统计学差异（图3，表2）。

2.2.3 RT-PCR结果：在17 d以后，Notch-1在正常组和ARM组都有表达，E17~21时正常组的表达较致畸组强，差异有统计学意义（图4，表2）。

3 讨论

肛门直肠畸形术后排便功能障碍与末端直肠的神经肌肉的异常发育导致肠道动力改变密切相关，而肠管的神经肌肉的形成过程非常复杂，受多种因素调控。

目前研究认为Notch信号通路对于胃肠道的胚胎形成、肠神经嵴干细胞（gut neural crest stemcells，GNCSC）的迁移增殖、分化及肠壁平滑肌的发育都有影响［5，6］。并在多种细胞的分化过程中起关键作用的通路［7］。Notch是一种进化保守的跨膜蛋白受体，Notch胞外区与相邻细胞表面的配体结合后被蛋白酶体切割，释放出具有核定位信号的胞内域NICD（intracelluar domain of Notch），NICD 进入细胞核后借助于RAM域和ankyrin重复序列与RBP-JK/CBF-1和Mastermind相互作用形成转录激活复合物，调控Hes和Hey家族基因等基因的表达［8］。Notch信号通路在中枢神经系统，对于维持神经干细胞的活性发挥至关重要的作用［9］，还能调节交感神经元的发育［10］，心脏内神经细胞的分化［11］。在脊椎动物中已经发现了4种Notch受体分子（Notch 1-4） 及五种配体（Jagged 1，2；Delta 1，3，4）。Sander GR.等人发现存在于肠神经系统的两种Notch信号通路分子，即Notch-1及Jagged-2均表达于MP的神经节处［12］。

表2 各组别Notch-1 mRNA及Notch-1蛋白定量对比结果（x±s）Tab.2 The expression of Notch-1 mRNA and protein in normal and ARM groups（x ±s）

基于Notch-1及Jagged-2在肠管发育中的角色，我们利用ETU致畸的ARM动物模型观察Notch-1及Jagged-2在畸形发生后末端直肠的表达，以期得到一些有益的启示。

本研究结果证明，在直肠胚胎发育中，Notch-1/Jagged-2在肠壁肌肉及神经系统中均有表达，与两者的发育过程同步，随着肠道发育的成熟，Notch-1/Jagged-2的表达也逐渐增强，实验结果提示Notch-1/Jagged-2信号分子在肠管的发育过程中，主要位于肠管的MP和肠壁平滑肌的环肌层，推测其可能对肠管神经肌肉发育起一定的的调控作用。

在ARM组，结果表明胚胎E16时，未见到阳性表达的细胞；E17后直肠壁内出现阳性细胞，上位结肠可见大量阳性细胞位于肠壁内；随着接近盲端，肠壁各层分化不良，阳性细胞分布逐渐减少，横断面上更显示出瘘管周围肌肉形态异常，也不能看到神经丛结构；E20~21，这种变化更加明显，Western Blot的实验结果与组化结果一致。RT-PCR的结果证实了上述基因mRNA水平的改变，与正常组相比，Notch-1及Jagged-2的表达明显降低。根据Notch-1及Jagged-2基因在ARM动物模型直肠壁表达水平的差异，推测它们可能与ARM末端直肠神经肌肉发育不良存在相关性。

Notch信号通路的调控机制非常复杂，如果揭示上述发育基因的确切调控机制仍然需要大量的深入实验。这也正是我们课题组下一步的研究方向，目前正在进行中。

［1］Hartman EE，Oort FJ，Aronson DC，et al.Explainingchangein quality of life of children and adolescents with anorectal malformations or Hirschsprungdisease［J］.Pediatrics，2007，119（2）：e374-e383.

［2］Lewis J.Notch signallingand thecontrol of cell fatechoices in vertebrates［J］．Semin Cell Dev Biol，1998，9（6）：583-589.

［3］Artavanis-Tsakonas S，Rand MD，Lake RJ．Notch signaling：cell fate control and signal integration in development［J］.Science，1999，284（5415）：770-776.

［4］Kageyama R，Ohtsuka T，Tomita K.The bHLH gene Hes1 regulates differentiation of multiplecell types［J］.Mol.Cells，2000，10（1）：1-7.

［5］Okamura Y，SagaY.Notch signaling is required for the maintenance of enteric neural crest progenitors［J］.Development，2008，35（21）：3555-3565.

［6］Nakamura T，Tsuchiya K，Watanabe M.Crosstalk between Wnt and Notchsignalinginintestinalepithelialcellfatedecision［J］.JGastroenterol，2007，42（9）：705-710.

［7］Kidd S，Kelley MR，Young MW．Sequence of the notch locus of Drosophilamelanogaster：relationship of theencoded protein tomammalianclottingand growthfactors［J］．Mol Cell Bio1，1986，6（9）：3094-3108．

［8］Iso T，Kedes L，Hamamori Y．HESand HERP families：multiple effectorsof the Notch signaling pathway［J］.JCell Physiol，2003，194（3）：237-255．

［9］Hitoshi S，Alexson T，Tropepe V，et al.Notch pathway molecules are essential for the maintenance，but not the generation，of mammalian neural stemcells［J］.Genes Dev，2002，16（7）：846-858.

［10］Tsarovina K，Schellenberger J，Schneider C，et al.Progenitor cell maintenance and neurogenesis in sympathetic ganglia involves Notch signaling［J］.Mol Cell Neurosci，2008，37（1）：20-31.

［11］High FA，Zhang M，Proweller A，et al.An essential role for Notch in neural crest during cardiovascular development and smooth muscle differentiation［J］.JClin Invest，2007，117（2）：353-363.

［12］Sander GR，BrookesSJ，Powell BC.Expressionof Notch1 and Jagged2 in theenteric nervoussystem［J］.JHistochem Cytochem，2003，51（7）：969-972.